根尖细胞有液泡吗(根尖细胞有液泡吗高中)？如果你对这个不了解，来看看！

人教版中考生物总复习要点速记（第二单元 生物体的结构层次）,下面一起来看看本站小编初中生物马老师给大家精心整理的答案，希望对您有帮助

根尖细胞有液泡吗(根尖细胞有液泡吗高中)1

要点显微镜的基本构造及其使用

1．显微镜的构造与功能

(1)能调节视野亮度的是遮光器和反光镜。光线过强，则选用小光圈和平面镜；光线太弱，则选用大光圈和凹面镜。

(2)能使镜筒上升或下降的是粗准焦螺旋(升降幅度大)和细准焦螺旋(升降幅度小)。

2．显微镜的使用方法：一取二放三安装；四转低倍五对光；六上玻片七下降；八升镜筒细观赏；九退整理十归箱。

3．镜筒下降时，眼睛一定要从侧面注视物镜，防止其压碎玻片。

4．显微镜的放大倍数＝目镜的放大倍数×物镜的放大倍数。

5．放大倍数越小，视野范围越大，看到的细胞数目越多，视野越亮。

6．显微镜下看到的是左右相反、上下颠倒的像。

7．如果要把物像移到视野中央，则物像往哪偏就把玻片往哪移，即“偏哪移哪”。

8．高倍镜的使用：先用低倍镜观察，移动玻片使物像到视野中央；再转动转换器换高倍物镜，转动遮光器和反光镜调整视野亮度；后用细准焦螺旋调节物像至清晰。

9．污点位置判断：视野中的污点只能在目镜、物镜和玻片上，转动目镜，污点随之移动，则污点在目镜上；移动玻片，污点移动，则污点在玻片上；转动目镜和移动玻片，污点均不动，则污点在物镜上。

1．临时装片制作的一般步骤

(1)洋葱鳞片叶内表皮细胞临时装片的制作过程：擦→滴(清水)→撕→展→盖→染(滴加稀碘液染色)。(如图)

(2)人口腔上皮细胞临时装片的制作过程：擦→滴(生理盐水)→刮→涂→盖→染(滴加稀碘液染色)。(如图)

2．盖盖玻片时要使其一边先接触液滴，然后缓缓放下另一边，避免出现气泡。

要点细胞是生命活动的基本单位

1．动、植物细胞的结构(如图)

植物细胞结构示意图　　　　　　　　　　动物细胞结构示意图

(1)动、植物细胞结构的异同点

(2)并非所有的植物细胞都有叶绿体，如表皮细胞、根尖细胞等没有叶绿体。

(3)液泡的细胞液中含有带酸、甜、苦、辣、咸、涩等味的物质。

(4)细胞膜控制物质的进出。

(5)细胞核是控制中心，遗传信息存在于细胞核中，克隆羊、克隆牛等可以证明。克隆技术属于无性繁殖。

2．细胞的能量转换器：植物细胞的能量转换器有叶绿体和线粒体，动物细胞的能量转换器只有线粒体。

要点细胞生长、分裂、分化

1．生物体由小长大，是与细胞的生长、分裂和分化分不开的。

2．细胞的生长：细胞从周围环境中吸收营养物质，将其转变成可以组成自身的物质，体积由小变大。

3．动、植物细胞的分裂过程比较

4．细胞分裂使细胞数目增多，其过程中染色体的变化如下：

(1)细胞分裂过程中，染色体的变化最明显。分裂时，染色体会复制，然后均分成完全相同的两份，分别进入两个新细胞中。

(2)新细胞与原细胞的染色体形态和数目相同。

5．细胞分化使细胞的种类增加，形成不同的组织。

6．植物体的主要组织(如图)

7．人体的四种基本组织(如表)

要点动植物体的结构层次

1．绿色开花植物的根、茎、叶为营养器官；花、果实、种子为生殖器官。人体的器官有心脏、肺、肾、眼、皮肤、唾液腺等。

2．系统：由能够共同完成一种或几种生理功能的多个器官按一定的次序组合在一起构成。人体有神经系统、呼吸系统、消化系统、循环系统、泌尿系统、生殖系统、运动系统等。

3．高等植物体的结构层次：细胞→组织→器官→植物体。没有系统这一结构层次。

4．高等动物体的结构层次：细胞→组织→器官→系统→高等动物体。

根尖细胞有液泡吗(根尖细胞有液泡吗高中)2

高中生物实验易错点归纳

（1）、可溶性还原性糖的鉴定：

植物组织应该选择苹果、梨等应该选择白色或者近于白色的组织，而不能选择西瓜；

鉴定的糖类为可溶性还原糖，故不能选用甘蔗作为实验材料；

实验过程中需要水浴加热；

若鉴定材料中不含可溶性还原糖，则实验结果的现象应该为蓝色，而非无色，答题时切忌描述为“无色”；

斐林试剂的配制为“等量混合均匀后使用，且须现配现用”，注意与双缩脲试剂的先加A液，后加少量B液区分开来。鉴定结果为斐林试剂在水浴条件下可与可溶性还原糖发生反应产生砖红色沉淀。

（2）、脂肪的鉴定实验：

材料选取得是富含脂肪的花生子叶，鉴定过程中须用显微镜进行观察，故而需要制片操作，若切片厚薄不均，会导致显微镜视野明暗不一；

在染色后，显微镜观察前，须用50%酒精溶液洗去浮色，便于我们区分被苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ染色的脂肪颗粒

（3）蛋白质鉴定实验：

材料选择：豆浆或者鸡蛋清（鸡蛋清须稀释，以避免试验后鸡蛋清粘附于试管壁上，不易清洗）

试剂配制：先加1~2mLA液，再加1~2滴B液。

实验原理：Cu（OH）2在碱性条件下与肽键发生络合反应，生成紫色络合物。（故而加热导致蛋白质空间结构发生改变引发的蛋白质变性之后的物质，仍能够与双缩脲试剂发生紫色络合反应）

实验拓展：将蛋白质与蛋白酶混合使其充分反应过后，再加入双缩脲试剂进行鉴定，仍能够发生紫色络合反应；将蛋白质+蛋白酶+多肽酶混合反应后，加入双缩脲试剂，实验结果依旧为紫色。【原因？】

（4）观察细胞内的叶绿体：

材料：黑藻（它是真核细胞还是原核细胞？为什么？）

（5）观察细胞内的线粒体：

材料：人的口腔上皮细胞（为什么不选择绿色植物细胞？）

试剂：健那绿试剂（染成蓝绿色）

细胞活性：实验过程中细胞始终保持活性，故而在制作装片的过程中，须滴加生理盐水（等渗溶液），而不能滴加蒸馏水；

（6）观察细胞内DNA和RNA的分布：

实验材料：人的口腔上皮细胞；

重要操作：HCl的作用：①增加细胞膜的通透性；②使DNA和蛋白质分开，便于染色剂染色；

试剂：吡罗红（RNA，故而细胞质被染成红色）；甲基绿（DNA，故而细胞核被染成绿色）

（7）植物细胞的质壁分离复原实验：

实验材料：植物的成熟细胞（不能选用根尖分生区和动物细胞）【满足两个条件：第一有细胞壁；第二有成熟大液泡】课本选用的实验材料为洋葱鳞茎外表皮（其液泡含有紫色色素，易观察）；

通透性比较：细胞膜、原生质层具有选择透过性；细胞壁具有全透性。故而质壁分离时，细胞膜与细胞壁之间的液体为——外界溶液；

重要概念：原生质层——细胞膜和液泡膜之间的物质我们统称为原生质层。与渗透装置相比，原生质层就相当于渗透装置中的半透膜，而非细胞膜相当于渗透装置中的半透膜

质壁分离发生的条件：细胞外液>细胞液，故而细胞原生质层失水皱缩。

质壁分离复原的条件：①细胞仍具有活性；②细胞外液浓度<细胞内液浓度。此时细胞吸水膨胀。

植物细胞不能发生质壁分离复原的原因归纳：

①细胞已经死亡（死亡原因——实验中试剂的浓度、处理的时间）

②细胞外液仍大于细胞内液

质壁分离复原实验的应用：①判定细胞死活；②在不破坏细胞结构的前提下，测定细胞液的浓度；③比较不同溶液的浓度；④比较不同细胞细胞液浓度的大小；

质壁分离实验的知识点拓展：①补充矿质元素对光合速率的影响（画出曲线图）；

②观察细胞内的线粒体试验中生理盐水（等渗溶液的作用）

③对考试试题中的“浓度”“稀释”等字眼的把握，一定要联想到“细胞在此浓度下是否吸水或失水”

④细胞膜的提取实验、血红蛋白的提取实验、DNA的提取试验中，使动物细胞破裂采用的方法就是将相应的红细胞置于蒸馏水中，使细胞吸水涨破。

（8）细胞膜的提取实验：

材料：哺乳动物的成熟红细胞（原因：排除细胞器膜和核膜的影响）

处理方法：将细胞置于蒸馏水中使其破裂，释放出内容物

底物：H2O2溶液（本实验的无关变量之一，在试验中需遵循等量原则）

实验组：在一定量H2O2中滴加适量肝脏研磨液

对照组：在等量H2O2溶液中滴加等量（相对肝脏研磨液而言）FeCl3溶液

结果描述：实验组产生气泡的速率更快（或者单位时间产生气泡的数量更多）

实验一： 底物：淀粉溶液

实验结果检测试剂：用斐林试剂检测反应产物

实验结果检测试剂：斐林试剂检测反应产物

【特别提醒：】实验一的检测试剂可用碘液代替斐林试剂；实验二不能用碘液代替斐林试剂。

①温度对酶活性的影响：低温降低酶的活性，高温导致酶失活（不可恢复）

②pH对酶活性的影响：过酸、过碱都会导致酶失活（不可恢复）

③最适温度和最适pH值的判定：必须是曲线图的“折点”

探究酶的最适pH值或者温度时，要注意相应的梯度设置，即遵循对照组原则；

在具体操作过程中始终遵循单一变量原则；

在操作顺序上应先设置好相应的条件——即温度梯度、pH梯度之后，再添加酶

Ⅳ影响酶触反应速率的因素：

反应物浓度 酶量 反应温度 pH值 生成物的积累量

ATP与ADP的相互转化不为可逆反应，其原因是相互转化过程中用到的酶不同

（10）探究酵母菌的呼吸方式：

Ⅱ.试验中常采用的无氧操作：

煮沸的蒸馏水（除去水中溶氧）、滴加植物油（隔绝空气）

Ⅲ.对无氧呼吸产物的检测：

CO2：Ca（OH）2 溶液（现象：澄清石灰水变浑浊）

溴麝香草酚兰溶液由蓝变绿再变黄

酒精：酸性重铬酸钾由橙黄色变为灰绿色

（11）叶绿素的提取和分离实验：

实验原理区分：提取实验原理：色素易溶于有机溶剂

分离实验原理：色素在层析液中溶解度大的扩散的快，溶解度小的扩散的慢

提取实验中所加试剂及其作用：

CaCO3 的作用：保护色素 【不加的结果：提取液颜色变浅，分离得到的最下面的两个条带变窄或者缺失】

SiO2的作用：使研磨充分 【不加的结果：提取液颜色变浅，分离得到的条带均变窄】

无水乙醇（或丙酮）的作用：提取色素（注意：考试时喜欢在这个地方将其错误的改为分离色素）

分离实验的操作细节：①滤纸条须剪去两个角，目的是使层析的前沿线保持水平；

②层析划线须细、直、齐；

③层析过程中层析液不得浸没滤液细线；

④层析过程中需加盖，目的是避免层析液的挥发；

分离及提取实验易混点：

混淆两者的原理、试剂及作用搭配。如试题选项里将层析液的作用描述为提取色素，考试须看清再作答。

（12）色素的光吸收图谱：

叶绿素a、b：主要吸收红橙光和蓝紫光；

叶黄素、胡萝卜素：主要吸收蓝紫光

以上色素对绿光的吸收值最低，故大棚不宜选择绿色薄膜，而最好选择无色或者白色的薄膜。

（13）细胞大小与物质运输的关系：

结论：琼脂块的表面积与体积之比随着琼脂块的增大而减小；NaOH扩散的体积与整个琼脂块的体积之比随着琼脂块的增大而变小

【拓展：】细胞表面积与体积比越大，物质交换效率越高。【注意看清效率、速率】

（14）观察根尖分生组织细胞的有丝分裂：

材料：根尖分生区【区别：根尖成熟区】

操作流程：根尖培养——解离——漂洗——染色——制片——观察

染色剂：龙胆紫或醋酸洋红

【特别提醒】：1.在显微镜下不能看到根尖细胞持续进行的分裂；

2.本实验中盐酸的解离是使组织细胞分散开，而非固定；固定是探究低温诱导染色体加倍试验中卡诺氏液的作用，是固定染色体形态，以便于观察；

3.注意实验流程：解离后是先漂洗，以避免盐酸处理时间过长破坏细胞结构，然后才染色，而非先染色，再漂洗。

（15）孟德尔的豌豆实验：

材料：豌豆【豌豆是自花传粉，闭花授粉植物；豌豆具有易于区分的性状】

豌豆异花传粉的流程：母本去雄——套袋——采集父本花粉——人工授粉——再套袋——获得成熟个体或种子；

孟德尔实验成功的原因：①选用了合适的实验材料——豌豆；

②采用了正确的研究方法——统计学；

③先研究一对性状，再进一步研究多对性状；

④提出了假说，并设计了适当的方法予以验证——测交。

（16）.性状分离比的模拟：

1.当Ⅰ、Ⅱ两组实验中，每个小球代表一个基因，则每次从其中某一个桶内抓取一个小球，可以模拟基因的分离，两个小桶内各拿出一个小球，则表示的是配子间的自由组合；

2.Ⅲ、Ⅳ组实验模拟的是两对等位基因的自由组合；

3.在抓取过程中，抓取的小球须放回原小桶；

4.在本实验中，每个小桶内的小球D、d所占比例相等，即各占50%，小桶内小球数目可不等，因为基因分离的前提是抽取D、d概率均等，跟数目无关。

（17）.观察蝗虫精母细胞减数分裂固定装片：

注意实验材料：精母细胞（生殖细胞）【注意：体细胞不能进行减数分裂，因而不可能出现四分体联会等现象】

（18）.低温诱导植物染色体数目的变化：

试剂：卡诺氏液【固定细胞形态的作用】

【拓展：】1.诱导染色体加倍的方法：低温、秋水仙素处理植株幼苗；

2.诱导染色体加倍作用时期：有丝分裂前期；

3.作用机理：抑制纺锤体的形成。

（19）调查人类遗传病：

【注意区分：】在患者家系中调查的是遗传方式，在人群中调查的是发病率。

（20）探究生长素类似物促进插条生根的最适浓度：

材料选取：枝条上的芽数目需均等

对照组的设置：浓度梯度

（21）用样方法调查草地中某种双子叶植物的种群密度：

方法：1.五点取样法： 2.等距取样法：

【取上不取下，取左不取右】

（22）培养液中酵母菌种群数量的变化：

【重要操作：】血小球计数板的使用：先加盖——再滴加菌液。

（23）土壤中小动物类群丰富度的研究：

研究方法：取样器取样法

（24）关于常见课本生物学史实：

Ⅰ.对生物膜的探究历程：

①欧文顿：膜是由脂质构成的；

②荷兰科学家用丙酮将人的红细胞中的磷脂提取出来平铺在水面上，其表面积为细胞膜表面积的两倍，由此得出结论：细胞膜中的磷脂双分子层必然排列为两层。

【拓展：】1.细胞膜具有选择透过性这一功能特性和流动性这一结构特性，其中功能特性是由结构特性决定的；

2.胞吞胞吐（如神经递质由前膜的释放、分泌蛋白分分泌）体现的是流动性而非选择透过性

3.物质跨膜运输过程中，穿过的生物膜的层数及磷脂分子层、磷脂双分子层的计算

Ⅱ.光合作用的探究历程：

①普利斯特里：植物可以更新空气；

②萨克斯：通过曝光叶片与遮光叶片的对照，证明的光合作用需要光照【实验前需黑暗处理植物，目的是消耗掉植物叶片残存的淀粉，碘蒸气处理前需用酒精除去叶片中的色素，目的是避免色素的干扰】

③鲁宾、卡门通过同位素标记法证明了光合作用过程中产生的O2中的O来自于H2O

④卡尔文通过标记14CO2 探明了CO2 中的碳的转移途径【卡尔文循环】

Ⅲ.DNA是主要的遗传物质

①格里菲斯——肺炎双球菌体内转化实验（小鼠）——转化因子

②艾弗里——肺炎双球菌体外转化实验——DNA是遗传物质【没有“主要”】

③赫尔希、蔡斯——T2噬菌体转化实验——DNA是遗传物质

④烟草花叶病毒实验——RNA是其遗传物质

【拓展：】DNA是主要的遗传物质，是针对所有生物而言的；对于具体的某种生物，不能说其遗传物质“主要”是DNA。

Ⅳ.生长素的发现历程：

①达尔文的实验：尖端能够产生某种刺激促进植物的生长；植物感光部位在尖端；伸长部位在下部。

②詹森的实验：尖端产生的影响可以通过琼脂传递给下部

③拜尔的实验：胚芽鞘的弯曲是由于尖端产生的影响在其下部分布不均造成的

④温特的实验：命名了生长素【但是不知道生长素的本质是吲哚乙酸】

（25）同位素标记法的应用实验归纳：

Ⅰ.同同位素示踪法探究分泌蛋白的合成和运输过程

Ⅱ.同位素示踪法探究光合作用过程中，O2中的的O的来源于H2O【鲁宾和卡门】

Ⅲ.卡尔文通过同位素示踪法探究光合作用暗反应中C原子的转移途径【卡尔文循环】

Ⅳ.噬菌体侵染试验中，赫尔希和蔡斯通过分别用35S和32P标记蛋白质和DNA，探究T2噬菌体的遗传物质是DNA；

Ⅴ.沃森和克里克用放射性同位素得出DNA的双螺旋结构模式【物理模型】

（26）实验中HCl的作用归纳：

观察细胞内DNA和RNA的分布试验中HCl的作用：①增加细胞膜的通透性；②使DNA和蛋白质分开，便于染色剂染色；

观察细胞的有丝分裂过程中HCl的作用：解离，使组织细胞分散开来，便于我们观察

（27）高中生物教学中常见的物理模型和数学模型：

物理模型：真核细胞三维模型、 细胞膜的流动镶嵌模型、DNA分子的双螺旋结构模型

数学模型：种群密度的调查及研究

①、在“观察根尖分生组织细胞的有丝分裂”实验中，培养根尖长度是5cm,剪取根尖长度是2-3mm(不是cm,千万注意啊！！！)

②、在“低温诱导植物染色体数目的变化”实验中，不定根的培养长度是1cm左右，剪取根尖长度是0.5-1cm。

③、分生区细胞的特点：细胞呈正方形（特别注意！），排列紧密，有的细胞正在进行细胞分裂，可以合成生长素，并由此通过极性运输至整个根部。

（29）涉及到显微镜的实验归纳：

①、只用到低倍镜：观察植物细胞的质壁分离和复原

②、不用显微镜的实验：可以目测的实验，如观察蛋白质的鉴定的实验结果

③、用到的电子显微镜：要求学生操作的实验均不要求电子显微镜

④、其余的实验均会用到高倍镜。

根尖细胞有液泡吗(根尖细胞有液泡吗高中)3

1、哺乳动物成熟的红细胞：无众多细胞器、无细胞核（与其运输氧气相适应） ，早期的哺乳动物的红细胞是有细胞核的，只有红细胞吸收葡萄糖的方式为协助扩散。而其他细胞吸收葡萄糖等单糖为主动运输，例如小肠粘膜细胞。 骆驼是个例外，它属于哺乳动物，但它的成熟红细胞中有细胞核。

2、根尖分生区细胞: 无液泡（严格讲有很多小液泡，但一般情况下作无液泡处理）、叶绿体.细胞形态呈正方形

3、植物伸长区细胞:已分化细胞,不具有分裂能力。只有成熟的植物细胞才有大液泡伸长区和成熟区是有液泡的

4、洋葱表皮细胞: 无叶绿体. (注意:大多数植物的表皮细胞都无叶绿体.)

5、叶肉细胞: 含叶绿体，存在于植物的见光部分，是高度特化的细胞，不能进行分裂；

（1） 有的少数植物没有叶绿体 比如 寄生植物 菟丝子 是黄色的

（2） 有叶绿体的植物不是每个细胞都有叶绿体 比如:大树的根细胞 就不是绿色的 没有叶绿体

（3） 有叶绿体的细胞不一定可以光合作用 比如植物叶片的叶脉细胞 有结构不完全的叶绿体 就不能进行光合作用

（4）叶的表皮细胞除保卫细胞外均无叶绿体

6、植物根部细胞：（包括植物的根分根冠区、根尖分生区.、根尖成熟区.、根尖伸长区）无叶绿体,。 植物的非绿色器官无叶绿体。蓝藻：不是植物能进行光合作用的细胞不一定有叶绿体；自养生物不一定是植物（例如：硝化细菌、绿硫细菌和蓝藻）

7、根尖成熟区（根毛区）细胞：细胞中没有叶绿体和中心体 细胞呈长方形，有根毛，中央大液泡；主要依靠渗透作用吸收水分，是吸收水分的活跃部分，也是吸收矿质元素最活跃的部分；是高度特化的细胞，不能进行分裂。可用于观察渗透作用但显微镜视野要调的暗一些

8、多细胞生物的成熟细胞,如人的肌肉细胞、神经细胞、成熟的红细胞、血小板等,植物的表皮细胞、叶肉细胞、筛管细胞等高度分化的细胞都是不能在分化的细胞

9、胚胎干细胞：体积小，细胞核大、核仁明显，能继续分裂分化，从早期胚胎和原始性腺提取

10、淋巴细胞、肝、肾细胞: 暂不分裂细胞.

11、神经元、肌细胞: 不分裂细胞.

12、精子：不具有分裂能力、仅有及少的细胞质在尾总部

13、卵细胞：人体最大的细胞

14、受精卵：细胞的全能性最高，能进行连续的有丝分裂，有细胞周期，是有性生殖的生物个体发育的起点

15、神经细胞：具突起,不具有分裂能力，人体最长的细胞

16、骨骼肌细胞：多核、能够收缩

17、白细胞：可以变形，有吞噬作用18、蛙的红细胞无丝分裂，和哺乳动物成熟的红细胞不同

19、酵母菌：真核单细胞真菌，有细胞壁，但成分与细菌和植物细胞不同；

兼性厌氧菌，正常条件下出芽生殖，环境恶劣是进行孢子生殖（有性生

殖）在生态系统中最为分解者存在。

20、大肠杆菌、乳酸（杆）菌、醋酸（杆）菌：单细胞原核细菌、

21、硝化细菌、铁细菌、硫细菌：化能合成细菌，均属于单细胞原核

22、根瘤菌：单细胞原核细菌，与豆科植物共生，其固氮作用，

23、人的口腔上皮细胞：观察线粒体.DNA的分布

24、菠菜叶肉细胞：观察叶绿体的实验材料。蛙的红细胞：进行无丝分裂；

25、癌细胞：糖蛋白减少.通透性变差。

26、水的光解不需要酶，光反应需要酶，暗反应也需要酶

27、脂肪消化后大部分被吸收到小肠绒毛内的毛细淋巴管，再有毛细淋巴管注入血液

28、冬小麦在秋冬低温条件下细胞活动减慢物质消耗减少，单细胞内可溶性还原糖的含量明显提高细胞自由水比结合水的比例减少活动减慢，是适应环境的结果

29、尿素是有机物，氨基酸完全氧化分解时产生有机物，既是氮源也是碳源

30、植物导管细胞：死细胞，位于木质部，运输水分和无机盐，从下向上运输

31、植物的筛管细胞：活细胞，位于韧皮部，运输有机物，从上向下运输，成熟的筛管细胞中没有细胞核也没有细胞器。

32、、高等植物无氧呼吸的产物一般是酒精，但是某些高等植物的某些器官的无氧呼吸产物为乳酸，如：马铃薯的块茎、甜菜的块根、玉米的胚等

33、水在细胞中含量一般是最多的。但动、植物体内一些储藏营养物质的细胞中，含量最多的物质却是它所储藏的营养物质，例如人的脂肪细胞中，含量最多的物质就是脂肪，而不是水。

34、线粒体一般是均匀地分布在细胞质基质中。但是它在活细胞中能自由地移动，往往在细胞内新陈代谢旺盛的部位比较集中。例如，线粒体在小鼠受精卵的分裂面附近比较集中。在心肌细胞中数量也很多

35、在真核细胞中一般都有线粒体，蛔虫的细胞、哺乳动物的成熟红细胞、植物筛管细胞例外。

36、人体内的酶的最适pH一般都接近中性。只有少数例外，如胃蛋白酶，它的最适pH为1.5～2.2。

37、矿质元素一般都是灰分元素。氮是一个例外。矿质元素本来就是指灰分元素，就是说将植物体烘干以后，再充分燃烧，矿质元素都以氧化物的形式存在于灰分中。氮在燃烧过程中以分子态氮和氮的氧化物的形式散失而不存在于灰分中，所以氮实际上并不是矿质元素，但是氮与灰分元素一样，也是植物从土壤中以无机盐的形式吸收来的，因此，一般将氮也归在矿质元素里一起讨论。

38、人体内各种组织的细胞间质中的蛋白质一般是由这种组织的细胞自行合成的。血液是个例外，大部分的血浆蛋白质（如白蛋白、纤维蛋白原等）是由肝脏合成的。

39、植物一般都是自养型生物。但菟丝子等寄生植物例外，它们是典型的异养型植

40、气孔两侧保卫细胞具有叶绿体，保卫细胞吸水时,气孔张开,保卫细胞失水时,气孔闭合

41、细胞学说---虎克---利用显微镜观察到的细胞是死细胞（蜂窝状的小室，并命名为细胞）

本通则适用于人用生物制品生产用动物细胞基质及检定用动物细胞,包括具有细胞库体系的细胞及原代细胞。细胞基质系指可用于生物制品生产的所有动物或人源的连续传代细胞系、二倍体细胞株及原代细胞。
 生产非重组制品所用的细胞基质,系指来源于未经修饰的用于制备其主细胞库的细胞系/株和原代细胞。生产重组制品的细胞基质,系指含所需序列的、从单个前体细胞克隆的转染细胞。生产杂交瘤制品的细胞基质,系指通过亲本骨髓瘤细胞系与另一亲本细胞融合的杂交瘤细胞系。
 一、对生产用细胞基质总的要求
 用于生物制品生产的细胞系/株均须通过全面检定,须具有如下相应资料,并经国家药品监督管理部门批准。
 应具有细胞系/株来源的相关资料,如细胞系/株制备机构的名称,细胞系/株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。这些资料最好从细胞来源实验室获得,也可引用正式发表文献。
 人源细胞系/株须具有细胞系/株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别、健康状况及病原体检测结果的相关资料。
 动物来源的细胞系/株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、供体的一般健康状况及病原体检测结果的相关资料。
 如采用已建株的细胞系/株,应具有细胞来源的证明资料。应从能够提供初始细胞历史及其溯源性书面证明材料的机构获得,且应提供该细胞在该机构的详细传代记录,包括培养过程中使用的所有原材料的详细信息,如种类、来源、批号、生产日期及有效期、制备或使用方法、质量标准及检测结果等。
 2. 细胞系/株培养历史的资料
 应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及细胞系/株建立过程的相关资料,包括所使用的物理、化学或生物学手段,外源插入序列,筛选细胞所进行的任何遗传操作或筛选方法、在动物体内传代过程以及细胞生长特征、培养液成分等;同时还应具有细胞鉴别、内源及外源因子检查结果的相关资料。
 应提供细胞传代历史过程中所用的细胞培养液的详细成分并应具有溯源性,如使用人或动物源性成分,如血清、胰蛋白酶、乳蛋白水解物或其他生物学活性的物质,应具有这些成分的来源、批号、制备方法、质量控制、检测结果和质量保证的相关资料。
 (二)细胞培养操作要求
 细胞取材、建库及制备全过程应具有可溯源性及操作的一致性,并对各个环节的风险进行充分的评估。
 所有类型细胞的供体应无传染性疾病或未知病原体的疾病。神经系统来源的细胞不得用于疫苗生产。
 与细胞培养相关的所有材料,特别是人源或动物源性材料,应按照本版药典的相关要求进行风险评估,选择与生产相适应的原材料,必要时进行检测。所有生物源性材料均应无细菌、真菌、分枝杆菌、支原体及病毒等外源因子污染。细胞培养过程中所用的牛血清及胰酶应符合本版药典的相关要求。
 细胞培养液中不得含有人血清。如果使用人血白蛋白,应使用获得国家药品监督管理部门批准的人用药品。
 细胞制备过程中不得使用青霉素或β-内酰胺(β-Lactam)类抗生素。配制各种溶液的化学药品应符合本版药典(四部)或其他相关国家标准的要求。
 应控制对细胞生长有重大影响的、关键的已知可变因素,包括规定细胞培养液及其添加成分的化学组成及纯度;所有培养用试剂应有制备记录并经检定合格后使用,应规定细胞培养的理化参数(如pH值、温度、湿度、气体组成等)的变化范围并进行监测,以保证细胞培养条件的稳定性。
 应结合生产工艺的特性,尽可能减少对细胞的操作。细胞收获及传代应采用可重复的方式,以保证收获时细胞的汇合率、孵育时间、温度、离心速度、离心时间以及传代后活细胞接种密度具有一致性。
 传代细胞的体外细胞龄可采用细胞群体倍增水平或传代水平计算。
 二倍体细胞的细胞龄通常以群体倍增水平计算,也可以每个培养容器细胞群体细胞数为基础,每增加1倍作为1世代粗略估算,即 1 瓶细胞传 2 瓶(1 : 2 分种率),再长满瓶为 1 世代;1 瓶细胞传 4 瓶(1 : 4 分种率)为 2 世代;1 瓶细胞传 8 瓶(1 : 8 分种率)则为 3 世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前 2/3 内。
 连续传代细胞系的细胞龄可以群体倍增水平计算,也可以按照固定的传代比率进行传代,每传代 1 次视为 1 代。
 细胞系建立过程中进行了对细胞特性有重要影响的操作,如导致细胞具有了成瘤性,或经细胞克隆及遗传修饰等操作的细胞,应被视为一个新的(或不同的)细胞系,应在原细胞名称后增加后缀或编号重新命名,并重新建立主细胞库。
 在细胞克隆过程中,应选择单个细胞用于扩增,详细记录克隆过程,并根据整合的重组 DNA 的稳定性、细胞基因组及表型的稳定性、生长速率、目的产物表达水平和完整性及稳定性,筛选具有分泌目的蛋白最佳特性的候选克隆,用于建立细胞种子。
 应在大多数细胞处于对数生长期时进行细胞冻存。应采用符合细胞培养物的最佳冻存方法;每一次冻存时均应采用相同的降温过程,并记录冻存过程。
 每一个细胞库冻存时,应将同一次扩增的处于相同倍增水平的细胞培养物合并,混匀后分装。每支冻存管中的细胞数应足以保证细胞复苏后可获得有代表性的培养物。
 对于一个新的细胞库,除早代培养物在组织采集时或重组细胞筛选时可能需要使用抗生素外,细胞建库培养时不应使用抗生素。
 生产人员应定期检查身体,已知患有传染性疾病的人员不能进行细胞培养的操作。在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作;在同一工作日进行细胞培养前,不得接触动物或操作有感染性的微生物。
 细胞库的建立可为生物制品的生产提供检定合格、质量相同、能持续稳定传代的细胞。
 细胞建库应在符合中国现行《药品生产质量管理规范》的条件下制备。
 三级细胞库管理包括细胞种子、主细胞库(MCB)及工作细胞库(WCB)的管理。在某些特殊情况下,也可采用细胞种子及 MCB 二级管理,但须得到国家药品监督管理部门的批准。
 由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体,或经过克隆培养而形成的均一细胞群体,通过检定证明适用于生物制品生产或检定。在特定条件下,将一定数量、成分均一的细胞悬液,定量均匀分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管,于液氮或 -130℃ 以下冻存,即为细胞种子,供建立主细胞库用。
 对于引进细胞,生产者获得细胞后,冻存少量细胞,经过验证可用于生物制品生产,此细胞可作为细胞种子,供建立主细胞库用。
 取细胞种子通过规定的方式进行传代、增殖后,在特定倍增水平或传代水平同次均匀地混合成一批,定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管,保存于液氮或 -130℃ 以下,经全面检定合格后,即可作为主细胞库,用于工作细胞库的制备。生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。
 工作细胞库的细胞由 MCB 细胞传代扩增制成。由 MCB 的细胞经传代增殖,达到一定代次水平的细胞,合并后制成一批均质细胞悬液,定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管中,保存于液氮或-130℃以下备用,即为工作细胞库。生产企业的工作细胞库必须限定为一个细胞代次。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制品。复苏后细胞的传代水平应不超过批准用于生产的最高限定代次。所制备的 WCB 必须经检定合格[见本通则“一、(四)细胞检定”中有关规定]后,方可用于生产。
 主细胞库和工作细胞库应分别存放。每一个库应在生产设施内至少 2 个不同的地点或区域存放。应监测并维护细胞库冻存容器,以保证细胞库贮存在一个高度稳定的环境中。
 非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。
 每种细胞库均应分别建立台账,详细记录放置位置、容器编号、分装及冻存数量、取用情况等。细胞库中的每支细胞均应具有细胞系/株名、代次、批号、编号、冻存日期、贮存容器的编号等信息。
 为保证细胞冻存后仍具有良好的活力,冻存前的细胞活力应不低于  90%,冻存后应取一定量的可代表冻存全过程的冻存管复苏细胞,复苏后细胞的活力应不低于 80%。二倍体细胞冻存后,应至少做一次复苏培养并连续传代至衰老期,检查不同传代水平的细胞生长情况。细胞冻存后,可通过定期复苏细胞及复苏后细胞的活力数据验证细胞在冻存及贮存条件下的稳定性。
 细胞检定主要包括以下几个方面:细胞鉴别、外源因子和内源因子的检查、成瘤性/致瘤性检查等。必要时还须进行细胞生长特性、细胞染色体检查,细胞均一性及稳定性检查。这些检测内容对于 MCB 细胞和 WCB 细胞及生产限定代次细胞均适用。
 细胞检定项目的基本要求见表1。细胞库建立后应至少对 MCB 细胞及生产终末细胞(EOPC)进行一次全面检定。当生产工艺发生改变时,应重新对 EOPC 进行检测。每次从 MCB 建立一个新的 WCB,均应按规定项目进行检定。

注:①表示生产终末细胞,是指在或超过生产末期时收获的细胞,尽可能取按生产规模制备的生产末期细胞。
 “+"为必检项目,“-"为非强制检定项目。
 (+)表示需要根据细胞特性、传代历史、培养过程等情况要求的检定项目。
 新建细胞系/株、细胞库( MCB 和 WCB)和生产终末细胞应进行鉴别试验,以确认为本细胞,且无其他细胞的交叉污染。细胞鉴别试验方法有多种,包括细胞形态、生物化学法(如同工酶试验)、免疫学检测(如组织相容性抗原、种特异性免疫血清)、细胞遗传学检测(如染色体核型、标记染色体检测)、遗传标志检测[如 DNA指纹图谱,包括短串联重复序列(STR)、限制片段长度多态性(RFLP-PCR)和内含子多态性(EPIC-PCR)法等]以及其他方法(如杂交法、PCR法、报告基因法等)。应至少选择上述一种或几种方法对细胞进行种属和细胞株间及专属特性的鉴别。
 取混合细胞培养上清液或冻存细胞管样品,依法检查(通则 1101),应符合规定。对于 MCB 及 WCB 培养物,至少取混合细胞培养上清液 10ml,尽可能采用薄膜过滤法检测。对于冻存细胞,至少取冻存细胞总支数的 1% 或至少 2 支冻存细胞管(取量大者),可采用直接接种法检测。
 取至少 107 个活细胞用培养上清液制备细胞裂解物,按照无菌检查法(通则1101)进行分枝杆菌检查。
 取细胞裂解物接种于适宜的固体培养基(如罗氏培养基或 Middlebrook 7H10 培养基),每个培养基接种 1ml 并做 3 个重复,并同时以不高于 100CFU 的草分枝杆菌菌液作为阳性对照。将接种后的培养基置于 37℃ 培养 56 天,阳性对照应有菌生长,接种供试品的培养基未见分枝杆菌生长,则判为合格。
 用于外源病毒因子检查的豚鼠接种法也可检测分枝杆菌,按表2所列方法进行试验和观察。豚鼠在注射前应观察4周,结核菌素试验为阴性者方可用于试验,观察期末应进行结核菌素试验,并剖检观察主要脏器是否有结节形成。结核菌素试验为阴性,主要脏器无结节,则为符合要求。
 也可采用经过验证的分枝杆菌核酸检测法替代培养法。
 取细胞培养上清液样品,依法检查(通则 3301),应符合规定。
 5. 细胞内、外源病毒因子检查
 应注意检查细胞系/株中是否有来源物种中潜在的可传染的病毒,以及由于使用的原材料或操作带入的外源性病毒。细胞进行病毒检查的种类及方法,须根据细胞的种属来源、组织来源、细胞特性、传代历史、培养方法及过程等确定。如 MCB 进行了全面检定,WCB 需检测的外源病毒种类可主要考虑从 MCB 到 WCB 传代过程中可能引入的病毒,而仅存在于MCB建库前的病毒可不再重复检测。
 (1)细胞形态观察及血吸附试验
 取混合瓶细胞样品,接种至少 6 个细胞培养瓶或培养皿,待细胞长成单层或至一定数量后换维持液,持续培养两周。如有必要,可以适当换液。逐日镜检细胞,细胞应保持正常形态特征。
 如为贴壁细胞或半贴壁细胞,细胞至少培养 14 天后,分别取 1/3 细胞培养瓶或培养皿,用 0.2%~0.5% 豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。一半加入红细胞后置 2~8℃ 作用 30 分钟,一半置 20~25℃ 作用 30 分钟,分别进行镜检,观察红细胞吸附情况,结果应为阴性。
 新鲜红细胞在 2~8℃ 保存不得超过 7 天,且溶液中不应含有钙或镁离子。
 (2)体外不同指示细胞接种培养法检测病毒因子
 用待检细胞培养上清液制备活细胞或细胞裂解物,分别接种至少下列三种单层指示细胞,包括猴源细胞、人二倍体细胞和同种属、同组织类型来源的细胞。待测样本检测前,可于 -70℃ 或以下保存。
 每种单层指示细胞至少接种 107 个活细胞或相当于 107 个活细胞的裂解物。接种量应占维持液的 1/4 以上,每种指示细胞至少接种 2 瓶。取培养 7 天的细胞各 1 瓶,取上清液或细胞裂解物再分别接种于新鲜制备的相应的指示细胞盲传一代,与初次接种的另一瓶细胞继续培养 7 天,观察细胞病变,并在观察期末取细胞培养物进行血吸附试验;取细胞培养上清液进行红细胞凝集试验。
 用  0.2%~0.5% 豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验和红细胞凝集试验。将混合红细胞加入细胞培养瓶,一半置于 2~8℃ 孵育 30 分钟,一半置于 20~25℃ 孵育 30 分钟,分别进行镜检,观察红细胞吸附情况。取细胞上清液从原倍起进行倍比稀释后,加入混合红细胞,先置 2~8℃ 孵育 30 分钟,然后置于 20~25℃ 孵育 30 分钟,分别观察红细胞凝集情况。
 接种的每种指示细胞不得出现细胞病变,血吸附试验及红细胞凝集试验均应为阴性。试验应设立病毒阳性对照,包括可观察细胞病变的病毒阳性对照、血吸附阳性对照及血凝阳性对照。如待检细胞裂解物对单层细胞有干扰,则应排除干扰因素。
 若已知待检细胞可支持人或猴巨细胞病毒(CMV)的生长,则应在接种人二倍体细胞后至少观察 28 天,应无细胞病变,且血吸附试验及红细胞凝集试验均应为阴性。
 (3)动物体内接种法检测外源病毒因子
 用待检细胞培养上清液制备活细胞(或适宜时采用相当量的细胞裂解物),接种动物体内进行外源病毒因子检测。待检细胞至少应接种乳鼠、成年小鼠和鸡胚(两组不同日龄)共计 4 组,如为新建细胞,还需接种豚鼠。原代猴肾细胞还需用家兔体内接种法或兔肾细胞培养法检查猴疱疹 B 病毒。按表 2 所列方法进行试验和观察。接种后 24 小时内动物死亡超过 20%,试验无效。

观察期内,如被接种动物出现异常或疾病应进行原因分析,观察期内死亡的动物应进行大体解剖观察及组织学检查,以确定死亡原因。如动物显示有病毒感染,则应采用培养法或分子生物学方法对病毒进行鉴定(如观察期内超过 20% 的动物出现死亡,且可明确判定为因动物撕咬所致),试验判定为无效,应重试。
 观察期末时,符合下列条件判为合格。
 ①乳鼠和成年小鼠接种组  至少应有 80% 接种动物健存,且小鼠未显示有可传播性因子或其他病毒感染。
 ②鸡胚接种组  卵黄囊接种的鸡胚至少应有 80% 存活,且未显示有病毒感染;尿囊腔接种的鸡胚至少应有 80% 存活,且尿囊液红细胞凝集试验为阴性。
 ③豚鼠接种组  至少应有 80% 接种动物健存,且动物未显示有可传播性因子或其他病毒感染。
 ④家兔接种组  至少应有 80% 接种动物健存,且动物未显示有可传播性因子或其他病毒感染(包括接种部分损伤)。
 (4)逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测
 可采用下列方法对待检细胞进行逆转录病毒的检测。
 ①逆转录酶活性测定  采用敏感的方法,如产物增强的逆转录酶活性测定法( PERT 或 PBRT 法)(本通则附录 1 或其他适宜的方法,但灵敏度不得低于现行方法),但由于细胞中某些成分也具有逆转录酶活性;因此,逆转录酶阳性的细胞,应进一步确认是否存在感染性逆转录病毒。
 ②透射电镜检查法  取至少 1×107 个活细胞采用超薄切片法进行透射电镜观察。
 ③ PCR 法或其他特异性体外法  根据细胞的种属特异性,在逆转录酶活性结果不明确或不能采用逆转录酶活性测定时,可采用种属特异性的逆转录病毒检测法,如逆转录病毒 PCR 法、免疫荧光法、ELISA 法等,逆转录病毒的定量 PCR 法还可用于逆转录病毒颗粒的定量。
 ④感染性试验  将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞,培养后检测。根据待检细胞的种属来源,须使用不同或多种的敏感细胞进行逆转录病毒感染性试验。
 不同的方法具有不同的检测特性,逆转录酶活性提示可能有逆转录病毒存在,透射电镜检查及特异性 PCR 法可证明是否有病毒性颗粒存在并进行定量,感染性试验可证明是否有感染性的逆转录病毒颗粒存在,因此应采用不同的方法联合检测。若细胞逆转录酶活性检测为阳性,则需进行透射电镜检查或 PCR 法及感染性试验,以确证是否存在感染性逆转录病毒颗粒。可产生感染性逆转录病毒颗粒,且下游工艺不能证明病毒被清除的细胞基质不得用于生产。
 已知鸡胚成纤维细胞(CEF)或其他禽源性细胞含有逆转录病毒序列,常可产生缺陷型逆转录病毒颗粒,逆转录酶活性为阳性,对这类细胞进行逆转录病毒检测时,可直接检测细胞基质中是否存在外源性逆转录病毒污染,如禽白血病病毒、禽网状内皮病肿瘤病毒、感染性内源性逆转录病毒。在某些情况下,也可通过监测鸡群,以保证无上述感染性逆转录病毒污染。
 小鼠及其他啮齿类动物来源的细胞系含有逆转录病毒基因序列,可能会表达内源性逆转录病毒颗粒,因此,对于这类细胞系,应进行感染性试验,以确定所表达的逆转录病毒是否具有感染性。对于特定啮齿类细胞(如 CHO、BHK21、NS0 和 Sp2/0),还应确定其收获液中病毒颗粒的量及其是否有感染性逆转录病毒,并应在生产工艺中增加病毒去除和(或)灭活工艺。仅有高度纯化且可证明终产品中逆转录病毒被清除至低于现行检测方法的检测限以下时,方可使用这类细胞。
 (5)种属特异性外源病毒因子的检查
 应根据细胞系/株种属来源、组织来源及供体健康状况等确定检测病毒的种类。若在 MCB 或 WCB 中未检测到种属特异性病毒,后续过程中不再进行重复检测。
 鼠源的细胞系,可采用小鼠、大鼠和仓鼠抗体产生试验(MAP、RAP 及 HAP)检测其种属特异性病毒。
 人源的细胞系/株,应考虑检测如人EB病毒、人巨细胞病毒(HCMV)、人逆转录病毒(HIV-1/2、HTLV-1/2)、人肝炎病毒(HAV、HBV、HCV)、人细小病毒 B19、人乳头瘤病毒、人多瘤病毒、难培养的人腺病毒和人疱疹病毒 -6/7/8 等。
 猴源细胞系/株应考虑检测猴多瘤病毒(如 SV40)、猴免疫缺陷病毒(SIV)等。
 这类病毒的检测可采用适当的体外检测技术,如分子检测技术,但所用方法应具有足够的灵敏度,以保证制品的安全。
 若在生产者建库之前,细胞基质在建立或传代历史中使用了牛血清,则所建立的 MCB 或 WCB 和(或)生产终末细胞至少应按照通则 3604 的要求检测一次牛源性病毒。取待检细胞用培养上清液制备成至少相当于 107 个活细胞/ml 的裂解物,进行检测。如果在后续生产过程中不再使用牛血清,且 MCB 和(或)EOPC 检测显示无牛源性病毒污染,则后续工艺中可不再重复进行此项检测。
 如果在生产者建细胞库之前,细胞基质在建立或传代历史中使用了胰酶,则所建立的 MCB 或 WCB 和(或)超过生产限定水平的细胞至少应检测一次与胰酶来源动物相关的外源性病毒,包括猪细小病毒或牛细小病毒。如在后续生产过程中不再使用胰酶,且 MCB 和(或)EOPC 检测结果显示无相关动物源性病毒污染,则后续工艺中可不再重复进行此项检测。如使用重组胰酶,应根据胰酶生产工艺可能引入的外源性病毒评估需要检测的病毒种类及方法。
 根据细胞的特性、传代历史或培养工艺等确定检测病毒的种类。有些细胞仅对某些特定病毒易感,采用上述检测方法无法检出,因此需要采用特定的方法检测,如对 CHO 细胞进行鼠细小病毒污染的检测等。
 成瘤性检查是确定细胞基质在动物体内是否能够形成肿瘤,是对细胞特性的鉴定。
 新建细胞系/株及新型细胞基质应进行成瘤性检查。
 某些传代细胞系已证明在一定代次内不具有成瘤性,而超过一定代次则具有成瘤性,如Vero细胞,因此必须进行成瘤性检查。
 用于疫苗生产的细胞系/株应进行成瘤性检查,但当未经遗传修饰的二倍体细胞被证明无成瘤性后,可不作为常规检查要求。
 已证明具有成瘤性的传代细胞,如 BHK21、CHO、HEK293、C127、NS0 细胞等,或细胞类型属成瘤性细胞,如杂交瘤细胞,用于生产治疗性制品时可不再做成瘤性检查。
 成瘤性检查的方法见本通则附录 2。具有成瘤性的新建细胞或新型细胞基质,需采用定量的方法进一步分析细胞成瘤性的大小,并计算该细胞的半数致瘤量(TPD50),并根据生产工艺及制品的特性,评估成瘤性的风险。
 体内法是成瘤性评价的标准,但对于某些细胞,也可采用软琼脂克隆形成试验或器官培养试验等体外法检测细胞的成瘤性,特别是对于低代次、在动物体内无成瘤性的传代细胞系。体外法的结果可作为细胞成瘤性评价的参考。
 致瘤性检查是保证细胞基质中不存在可使细胞永生化并具有形成肿瘤的因子。细胞基质致瘤性可能与细胞 DNA(或其他细胞成分)或细胞基质中含有致瘤性因子相关。来源于肿瘤的细胞或因未知机制形成肿瘤表型的细胞,含有致瘤性物质的理论风险性相对较高。
 已建株的或有充分应用经验的连续传代细胞,如 CHO、NS0、Sp2/0、低代次的 Vero 细胞不要求进行致瘤性检查。
 新型细胞基质,特别是成瘤性为阳性的细胞,用于疫苗生产时,需进行致瘤性检查。
 可采用待测细胞裂解物和(或)细胞 DNA 按照本通则附录 3 的方法进行致瘤性检查。如根据细胞基质的表型或来源疑似有致瘤性病毒,建议用细胞基质裂解物接种动物进行致瘤性检查;若细胞基质具有成瘤性表型,建议用细胞 DNA 接种动物进行致瘤性检查。
 对致瘤性检查中出现进行性结节的细胞,应开展进一步的研究,鉴别致瘤性因子或致瘤性活性,并确定细胞的可适用性。
 生产用原材料的选择和细胞操作环境应符合本通则“一、(二)细胞培养操作要求”及“一、(三)1. 细胞库的建立”中有关规定。
 从冻存的 WCB 中取出 1 支或多支安瓿,混合后培养,传至一定代次后供生产用。其代次不得超过该细胞用于生产的最高限定代次。生产用细胞的最高限定代次应根据研究结果确定,但不得超过国际认可的最高限定代次。从 WCB 取出的细胞经增殖后获得的细胞不得再回冻保存用于生产。
 二、连续传代细胞系的特殊要求
 传代细胞系一般是由人或动物肿瘤组织或正常组织传代或转化而来,可悬浮培养或采用微载体培养,能大规模生产。这些细胞可无限传代,但到一定代次后,成瘤性会增强。应按本通则“一、(四)细胞检定”的规定进行细胞库的检查。对生产过程中细胞培养的要求如下。
 用于生产的传代细胞系,代次应有一定限制。用于生物制品生产的细胞最高限定代次须经批准。
 2. 生产过程中的细胞检查
 除另有规定外,病毒类制品,在生产末期,取不接种病毒的对照细胞,按本通则“一、(四)1. 细胞鉴别试验,2. 细菌、真菌无菌检查,4. 支原体检查”以及病毒外源因子检查法(通则 3302),应符合规定。
 三、人二倍体细胞株的特殊要求
 新建的人二倍体细胞必须具有以下资料:建立细胞株所用胎儿的胎龄和性别、终止妊娠的原因、所用胎儿父母的年龄、职业及健康良好的证明(医师出具的健康状态良好、无潜在性传染病和遗传性疾患等证明),以及胎儿父系及母系三代应无明显遗传缺陷疾病史的书面资料。
 人二倍体细胞株应在传代过程的早期,选择适当世代水平( 2~8 世代)增殖出大量细胞,定量分装后,置液氮中或 -130℃ 下冻存,供建立细胞种子之用,待全部检定合格后,即可正式定为细胞种子,供制备 MCB 用。
 1. 染色体检查及判定标准
 新建人二倍体细胞株及其细胞库必须进行染色体检查。对于已建株的人二倍体细胞株,如 WI-38、MRC-5、2BS、KMB17 等,在建立 MCB 时可不必进行细胞染色体检查;但如对细胞进行了遗传修饰,则须按新建细胞株进行染色体检查。
 新细胞建株过程中,每 8~12 世代应做一次染色体检查,在1株细胞整个生命期内的连续培养过程中,应至少有 4 次染色体检查结果。每次染色体检查,应至少随机取 1000 个分裂中期细胞,进行染色体数目、形态和结构检查,并做记录,以备复查。其中至少选择 50 个分裂中期细胞进行显微照相,作出核型分析,并应粗数 500 个分裂中期细胞,检查多倍体的发生率。
 每次染色体检查,应从同一世代的不同培养瓶中取细胞,混合后进行再培养,制备染色体标本片。染色体标本片应长期保存,以备复查。
 可用 G 分带或 Q 分带技术检查 50 个分裂中期细胞染色体带型,并作出带型分析。

 每 8~12 世代细胞培养物,应进行无菌检查,依法检查(通则 1101),应符合规定。
 每 8~12 世代细胞培养物,应进行支原体检查,依法检查(通则 3301),应符合规定。
 二倍体细胞株传代过程中,至少对 2 个不同世代水平进行病毒包涵体及特定人源病毒检查[见本通则一、(四)5.(5)种属特异性外源病毒因子的检查],结果应均为阴性。
 每 8~12 世代应做一次成瘤性检查[方法见本通则一、(四)6. 成瘤性检查],结果应无成瘤性。
 6. 生产过程中的细胞检查
 除另有规定外,在生产末期,取不接种病毒的细胞作为对照,进行以下各项检定,应符合规定。
 可根据制品特性及生产工艺,确定是否进行生产过程中细胞的染色体检查。通常含有活细胞的制品或下游纯化工艺不足的制品,应对所用细胞进行染色体检查及评价[见本通则三、1. 染色体检查及判定标准];但如采用已建株的人二倍体细胞生产,则不要求进行染色体核型检查。
 按本通则“一、(四)细胞检定”项下细胞鉴别试验进行。生产用细胞每年应至少进行一次该项检定。
 (5)对照细胞外源病毒因子检查
 四、重组细胞的特殊要求
 重组细胞系通过 DNA 重组技术获得的含有特定基因序列的细胞系,因此重组细胞系的建立应具有细胞基质构建方法的相关资料,如细胞融合、转染、筛选、集落分离、克隆、基因扩增及培养条件或培养液的适应性等方面的资料。细胞库细胞的检查除应按本通则“一、(四)细胞检定”的规定进行,还应进行下述检查。
 生产者须具有该细胞用于生产的目的基因的稳定性资料,稳定性检测的项目及方法依据产品的特性确定,对于细胞基质来说,稳定性的分析是保证 MCB/WCB 与 EOPC 之间的一致性,包括重组细胞的遗传稳定性(如插入基因拷贝数、插入染色体的位点、插入基因的序列等)、目的基因表达稳定性、目的产品持续生产的稳定性,以及一定条件下保存时细胞生产目的产品能力的稳定性等资料。
 除按本通则“一、(四)1. 细胞鉴别试验”进行外,还应通过检测目的蛋白基因或目的蛋白进行鉴别试验。
 五、原代细胞的要求
 原代细胞应来源于健康的动物脏器组织或胚胎,包括猴肾、地鼠肾、沙鼠肾、家兔肾、犬肾等动物脏器或动物的胎儿和其他组织,以及鸡胚和鹌鹑胚等正常组织,以适当的消化液消化、分散组织细胞进行培养,原代细胞不能建立细胞库,只能限于原始培养的细胞或传代少数几代内(一般不超过 5 代)使用,无法事先确定细胞代次。因此,只能严格规范管理和操作措施,以保证以原代细胞为基质所生产的制品质量。
 (一)动物组织来源和其他材料
 应符合“凡例”的有关要求。对各种动物都应有明确健康状况和洁净级别要求。
 多采用非洲绿猴、恒河猴等,中国以恒河猴为主。应为笼养或小群混养的正常健康猴。动物用于制备细胞前,应有6周以上的检疫期,检疫期中出现病猴或混入新猴,应重新检疫。从外面新引入的猴群应做结核菌素试验及猴疱疹I型病毒( B 病毒)的检查。
 胎猴肾可用于生产,对其母猴应进行检疫。
 (二)原代细胞培养物的检查
 用于细胞制备的动物剖检应正常,取留的器官组织亦应正常,如有异常,不能用于制备细胞。
 1. 细胞培养原材料检查及细胞培养操作
 按本通则“一、(二)细胞培养操作要求”项进行。
 细胞在接种病毒或用于生产前,其培养物均应进行外观检查和镜检,应无任何可疑、异常和病变,否则不得用于生产。
 原代猴肾细胞培养应检查 SV40 病毒、猴免疫缺陷病毒和 B 病毒;应采用 Vero 或原代绿猴肾细胞、兔肾细胞检查。地鼠肾原代细胞应采用 BHK21 细胞培养检查。观察细胞形态,如有可疑应在同种细胞上盲传一代继续观察。
 (3)对照细胞外源病毒因子检查
 六、检定用细胞的要求
 检定用细胞是指用于生物制品检定的细胞,包括原代细胞、连续传代细胞或二倍体细胞,以及经特定基因修饰过的细胞。检定用细胞的质量对检定结果的判定具有重要的影响,为保证检定结果的有效性、可靠性及真实性,检定用细胞应符合下列要求。
 1. 检定用细胞应具有明确合法来源的证明资料。
 2. 如使用传代细胞系/株,应建立细胞库体系,即主细胞库及工作细胞库,如细胞使用量较少,可建立单一主细胞库。应根据制品特性,在保证检测结果可靠性的基础上,通过验证确定该细胞允许使用的最高限定代次,在此基础上规定检定用细胞的使用代次范围。检定时从工作细胞库复苏细胞后,不能再回冻保存。
 3. 应详细记录检定用细胞建库的过程,包括细胞培养所用原材料的来源、批号,细胞生长液的配制方法、使用浓度等,以及细胞的传代及冻存过程,并建立细胞冻存及使用台账。
 应至少进行以下 1~3 项检定,根据检定用细胞用途的不同,还应进行以下其他相关项目的检定。
 按本通则“一、(四)1. 细胞鉴别试验”项进行,或其他适宜的方法,应确认为本细胞,并且无其他细胞的交叉污染。
 采用本通则“一、(四)5.(2)体外不同指示细胞接种培养法检测病毒因子”项及本通则“一、(四)5.(3)动物体内接种法检测外源病毒因子”项检查,应无外源病毒污染。
 用于成瘤性检查的阳性对照细胞,应采用本通则“一、(四)6. 成瘤性检查”项进行检查,应具有成瘤性。
 用于检测活疫苗制品病毒滴度的细胞,应进行此项检查,证明所用细胞具有足够的相应病毒敏感性。
 用于生物学活性、效力或效价测定的细胞,应进行此项检查,证明所用细胞能够有效评价待检样品质量。
 本法系以噬菌体 MS2 RNA 为模板,经反转录后再采用实时荧光定量PCR法检测特异性扩增信号,从而测定供试品中的逆转录酶活性。
103pU/μl,每次稀释时均采用新吸头吸取样本。
 将已处理的供试品及阳性对照用 A 液做 10 倍稀释。
 在相应的反转录反应管中分别加入5μl已稀释的标准曲线样品、供试品、阳性对照及灵敏度对照,以 A 液作阴性对照。反转录反应体系为 25μl。37℃ 反应 4 小时。
 (1)实验方法灵敏度认可标准
 实验方法的灵敏度为合格。
 标准曲线R应不低于 0.960,阳性对照应为阳性,Ct 值应≤28;灵敏度对照应为阳性,Ct 值应≤38;视为试验有效。
 ①如果待测样本无 Ct 值结果,或 Ct 值≥40,且无明显的扩增曲线,则判定待测样本中逆转录酶活性为阴性。
 ②如果待测样本的 Ct 值结果<40,且有明显的扩增曲线,则按照下式计算样本中逆转录酶活性单位。
 (1)如供试品为培养细胞,则将细胞传代后,培养 3~4 天长成单层,取上清液检测,取供试品前不得换液。
 (2)试验中所有试剂及吸头均需灭菌。与 RNA 操作有关的试剂及材料均需经过 DEPC 处理。
 (3)标准品稀释时,用新吸头吸取上一个稀释度样本加至下一个稀释管中,反复吹吸 10 次,并涡旋混合均匀,然后换新吸头进行下一个稀释。
 (4)与样本相关的操作建议使用带滤芯吸头,并注意实验分区。
 (5)定期对各区进行消毒,PCR 产物及其加供试品吸头应及时进行有效处理。
 成瘤性是指待检细胞接种动物后,接种细胞在动物体内形成(肿)瘤的过程,成瘤性检查的目的是确定细胞基质接种动物后形成(肿)瘤的能力。
 从 MCB 或 WCB 复苏细胞,扩增至或超过生产用细胞龄限定代次 10 代以上,收获细胞并悬于无血清液体中(如 PBS),制备成浓度为每 1ml 含 5×107 个活细胞的待检细胞悬液,细胞活力应不低于 90%,用于成瘤性检测。
 用 HeLa 或 HeLa S3 细胞或其他已知成瘤性为阳性的细胞,扩增至所需细胞量,用与待检细胞相同的液体悬浮细胞,并制备成浓度为每 1ml 含 5×106 个活细胞的悬液,细胞活力应不低于 90%,作为阳性对照细胞。
 如需要,可用人二倍体细胞作为阴性对照,扩增至所需细胞量,用与待检细胞相同的液体悬浮细胞,制备成浓度为每 1ml 含 5×107 个活细胞的待检细胞悬液,细胞活力应不低于 90%,作为阴性对照细胞。
 下述两种动物可任选其一。
 待检细胞组每只裸鼠皮下或肌内注射待检细胞 0.2ml(即每只裸鼠接种 107 个活细胞);阳性对照组每只注射阳性对照细胞 0.2ml,含 106 个活细胞。皮下接种时细胞应接种于裸鼠背部区域,肌肉接种时细胞应接种于裸鼠大腿部位。对于弱成瘤性表型的细胞或新建细胞,最好再使用新生裸鼠进行成瘤性试验,每只接种 0.1ml,含 107 个活细胞。
 应定期观察及触摸所有动物在注射部位是否有结节形成,至少观察 16 周(至少 4 个月),前 3~6 周,每周观察 2 次,之后每周观察 1 次,并记录结果。
 结果分析及判定
 (1)如注射部位有结节形成,应对结节进行双向测量,并记录每周的测量结果,以判定结节是否为进行性、稳定还是消退。
 (2)阳性对照组应至少有 9 只动物有进行性肿瘤生长时,试验才视为有效。
 (3)对出现的结节开始消退的动物,应在观察期末处死。不能形成进行性结节的细胞,不视为具有成瘤性。
 细胞在动物体内没有形成进行性结节,但结节在观察期内始终存留,且具有瘤的组织病理学形态时,则需考虑是否需要开展进一步的检测,如延长观察时间或采用新生裸鼠或其他动物模型分析细胞是否具有成瘤性。
 (4)在观察期末,处死所有动物,包括对照组动物,肉眼及显微观察注射部位及其他部位(如心脏、肺、肝、脾、肾、脑及局部淋巴结)是否有接种细胞增生。将这些组织用 3.7%~4.0% 甲醛溶液固定、切片,并用苏木精和伊红染色后进行组织病理学检查,判定接种细胞是否形成肿瘤或有转移瘤。如果有转移瘤形成,则需进一步分析转移瘤的性质及与原发瘤的相关性,并深入分析转移瘤形成的原因。
 (5)如待检细胞接种组 10 只动物中至少有 2 只在注射部位或转移部位形成瘤,并且组织病理学及基因型分析显示形成瘤的细胞性质与接种的细胞一致时,则可判定为待检细胞具有成瘤性。
 (6)如待检细胞接种组 10 只动物中仅有 1 只形成瘤且满足本检查法(5)的条件,则待测细胞可能具有成瘤性,需要做进一步的分析。
 致瘤性是指将待检细胞的细胞成分接种动物后,诱导动物本身细胞形成肿瘤的特性,可参照下列方法进行检查。
 接种动物及数量
 采用新生(出生 3 日龄内)裸鼠、新生仓鼠及新生大鼠进行致瘤性检查,动物接种数量应多于成瘤性检查用量。
 来源于 MCB 或 WCB 的细胞扩增至或超过生产用体外细胞龄至少 3~10 个细胞倍增水平,用于致瘤性检查。
 细胞裂解物阳性对照尚不明确,DNA 阳性对照可采用含有致瘤性基因的在动物体内可引起致瘤的 DNA 质粒。设置阴性对照可监测接种动物的自发肿瘤发生频率。设置阴性对照可根据具体情况而定,可采用 PBS 作为阴性对照。
 供试品制备及接种
 采用对病毒破坏最小且能最大释放病毒的方法制备细胞裂解物,如可采用 3 次冻融及低速离心法,将样本悬浮于 PBS 中,取含 107 个细胞的裂解物 50~100μl 分别于肩胛骨处皮下接种新生裸鼠、新生仓鼠及新生大鼠。接种前应确认样本中无活细胞存在,以免影响结果的有效性。
 提取细胞基质全细胞 DNA 悬浮于 PBS 中,可适度进行超声波等剪切处理,取 50~100μl 含不低于 100μg 的 DNA 样本分别于肩胛骨处皮下接种新生裸鼠、新生仓鼠及新生大鼠。阳性对照组应将阳性对照质粒与待测细胞 DNA 混合后接种,以确认待测样本无抑制效应。
 结果观察及分析
 (1)每周观察并触摸接种部位是否有结节形成,应至少观察 4 个月。
 (2)观察期内如有 1 个或多个结节出现,则应每周双向测量结节大小并记录结果,以确定结节是进行性生长、保持稳定还是随时间而消退。有进行性结节生长的动物,当结节达到直径约 2cm 或国家规定的大小时应处死。
 (3)观察期末,所有动物均应处死,肉眼及显微观察接种部位或其他部位是否有瘤形成。任何疑似瘤均应采用适宜浓度甲醛溶液固定后进行组织学检查。如可行,建立细胞系并冻存后,以备进行后续的分子技术分析。
 (4)显微检查肝、心、肺、脾及局部淋巴结是否存在转移性损伤。如有肿瘤形成,则要分析与接种部位原发瘤的相关性;如组织学检查显示与原发瘤不同,则要考虑可能有自发瘤形成,这种情况需跟踪结果。
 (1)观察期末,如接种部位或其他远端部位未观察到进行性生长肿瘤,可判定细胞无致瘤性。
 (2)在致瘤性检查中形成的所有肿瘤均应检查其基因组 DNA,分析是否有细胞基质物种来源的 DNA 及接种动物来源的 DNA,致瘤性试验中形成的肿瘤应为接种动物宿主 DNA。保存所有的肿瘤样本,以备必要时开展深入研究。
 (3)对致瘤性检查中出现进行性结节的细胞基质,应考虑开展进一步的研究,鉴别致瘤性因子或致瘤性活性,并确定细胞的可适用性。