你们的0.1%结晶紫染色液（G1063）可以只染活细胞荧光显微镜而不死细胞吗，还是说要控制染色时间？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2024-04-19 14:58 标签： 活细胞荧光显微镜

细菌染色分为活菌染色跟死菌染色两种。其中死菌染色分为正染色跟负染色。正染色又包括普通染色与特殊染色两种。普通染色有简单染色法、革兰氏染色法和抗酸染色法；特殊染色分为芽孢染色法、荚膜染色法和细胞壁染色法。一般都只用革兰氏染色法跟抗酸染色法。革兰氏染色法(Gram's stain)是最常用的细菌染色法。细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。①将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1min。②水洗后加芦戈氏碘液处理(媒染)1min。③水洗后用95％酒精脱色，脱色时频频摇动玻片，直至流下的液体无色为止(约需0.5min)。④水洗后加石炭酸复红稀释液染色(复染)0.5min。⑤水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检。染色过程中，水洗要用自来水的细流徐徐冲洗，冲洗涂膜的背面，勿使强水流直接冲到涂膜上。抗酸染色法（acid-fast stain）对分枝杆菌属等一般染色法不易着色的抗酸性细菌染色。要注意：1）涂片要略厚；2）加温染色或延长染色时间，加温时随时补加染色液；3）分枝杆菌呈红色（+），其他细菌和背景为蓝色。①石碳酸复红加温染色8~10分钟。②3%的盐酸酒精脱色约1~2分钟，脱色是轻摇玻片，直到涂片颜色脱去为止。③水洗后，用碱性美蓝复染1分钟。④再次水洗，印干。 芽孢染色法是专门给细菌芽孢染色的。要注意：1）芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜；2）染色加热过程要及时补充染液，切勿让涂片干涸。①孔雀绿加热染色5分钟。②水洗。③番红染色2~3分钟。④水洗，干燥。 荚膜染色法是专门给与染料亲和性弱的细菌荚膜染色。由于荚膜很薄，且含水量高（90%以上），易变形，所以制片和染色时一般不用热固定。这个包括黑素负染色法、Leifson染色法跟Tyler染色法。黑素负染色法：1.制菌液：在洁净载破片一端加一滴蒸馏水，按无菌操作要求，用接种环取少量斜面试管培养物于蒸馏水中，轻轻混匀。2.涂片（推片法）：取另一块边缘光滑的载玻片，使之一端与菌液接触，然后迅速均匀地将菌液推向玻片的另一端，使菌液涂成一薄层。置空气中自然干燥。注意：勿热固定。3.复红染色：滴加石炭酸复红染色液覆盖涂布面，染色4~5分钟后，除去多余染液（勿用水洗）。干燥时间不要太长，防荚膜脱水。4.黑素染色：在玻片一端加一滴1%黑素液，再取一块边缘光滑的裁玻片，当边缘与黑素液接触后，迅速均匀地推向玻片另一端，使成一薄层。置空气中自然干燥。 5. 镜检（油镜）：菌体呈红色，背景呈黑色，荚膜无色。注意事项：滴黑色素要量少；取菌要适量。Leifson染色法1.制备涂片同前，自然干燥。2.滴加Leifson’s染色液覆盖涂布面，染色10分钟，倾去多余染料（勿用水洗）。3.滴加硼酸钠美蓝染色液，染色5分钟，轻轻用水冲洗，置空气中自然干燥。4.油镜下镜检，菌体呈蓝色，荚膜呈红色。Tyler染色法1.制备涂片同前，自然干燥。2.滴加结晶紫冰醋酸染色液覆盖涂布面，染色5~7分钟。倾去多余染料（勿用水洗）。3.用20%CuS04水溶液轻轻冲去染料，用吸水纸印干后，置空气中自然干燥。4.油镜下检查，菌体呈紫色，荚膜呈浅紫色或浅蓝色。 细胞壁染色法是观察细菌细胞壁时采用的染色法。细菌细胞壁很薄，它与染料结合的能力差，不易着色，在细菌的染色过程中，一般情况染料都是通过细胞壁的渗透、扩散等作用而进入细胞，细胞壁本身并未染色，因此，欲通过染色来观察细胞壁，必须设法使细胞壁能着色，而细胞质则不易着色，常用的方法有单宁酸法和磷钼酸法。单宁酸和磷钼酸都是起媒染作用，它们使细胞壁形成可着色的复合物，而使细胞质不易被着色，经结晶紫或甲基绿染色后，便可在普通光学显微镜下观察到细胞壁。根据细菌细胞在高渗溶液中或用乙醚蒸气处理后，会产生质壁分离这一现象，经染色后也可在普通光学显微镜下区分细胞壁和细胞质膜。1．单宁酸法(1)将培养16—18小时的巨大芽孢杆菌按常法制成涂片。(2)用5％单宁酸染5分钟后，水洗。(3)用0．2％结晶紫染3—5分钟，水洗，吹干。用油镜观察，细胞壁呈紫色，细胞质呈淡紫色。2．磷钼酸法(1)制备浓厚的涂片，在未干时浸入1％磷钼酸水溶液3—5分钟。(2)用1％甲基绿水溶液染3—5分钟。(3)水洗后，吹干，用油镜观察。细胞壁为绿色，细胞质无色。3．区分细胞壁与细胞质膜(1)乙醚蒸气法(a)将巨大芽孢杆菌涂布于盖玻片上，翻转盖玻片使其放在乙醚蒸气瓶的瓶口上蒸3分钟。(b)取下盖玻片置Bouin氏固定液中30分钟后取出，水洗。(c)用硫堇染色30秒钟。(d)水洗，水封，置油镜下观察。(2)NaCl法(a)取一滴25％NaCl溶液于洁净的载玻片上。(b)挑一小环培养6小时的枯草芽孢杆菌，在25％NaCl水滴中涂布均匀，待自然干燥。(c)滴加0．01％结晶紫于其上，使盖满有菌部分，30秒钟后水洗，干燥，用油镜观察结果。
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常用的细菌染色方法有简单染色和革兰氏染色。1、简单染色是利用单一染料对细菌进行染色，常用碱性染料如美蓝、结晶紫、碱性复红等。方法很简单：（一）制片：进行无菌涂片->自然风干->微火固定 （二）染色：例如用美蓝染色3-5分钟，滤纸吸干后就可以置于显微镜下观察了2、革兰氏染色：使用非常普遍。方法：（1）用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染（2）用碘液进行媒染（3）用乙醇冲洗以脱色（4）用一种与结晶紫不同颜色的碱性染料进行复染如沙黄。这些实验都很简单，到时候你亲自做一遍就会很明白了，你现在只需弄清原理和简单过程就行。
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