如何确定设计的引物PCR时的反应条件(引物,不能确定,设计引物,引物设计) - PCR实验 - 生物秀
标题: 如何确定设计的引物PCR时的反应条件(引物,不能确定,设计引物,引物设计)
摘要: [如何确定设计的引物PCR时的反应条件(引物,不能确定,设计引物,引物设计)] 各位高手，我最近在设计引物，但不能确定引物设计后的PCR反应条件，如退火温度等，另外在我的引物中打算5端引入限制性酶切位点，我不知道除了特定的酶需要加特定的保护碱基外，还需要注意些什么问题，加酶切位点后是否会影响引物的质量，谢谢！ 关键词:[引物 引物设计 设计引物 不能确定 保护碱基 酶切位点 退火温度]……
各位高手，我最近在设计引物，但不能确定引物设计后的PCR反应条件，如退火温度等，另外在我的引物中打算5端引入限制性酶切位点，我不知道除了特定的酶需要加特定的保护碱基外，还需要注意些什么问题，加酶切位点后是否会影响引物的质量，谢谢！
个人一点经验：退火温度一般的设计软件会推荐（如ｏｌｉｇｏ），如果软件推荐的退火温度没有P出来，可以在此温度的基础上上调或下调５度，剃度２度，所加酶切位点保护碱基数，不同的限制酶根据其酶切活性略有不同，一般加３个，加酶切位点和保护碱基后的引物，为了增加其扩增特异性，应保证其与模板互补的核苷酸数即同源性。1. primers design 这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件 a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量 b. GC% 40%~~~~60% c. 5"端和中间序列要多GC,以增加稳定性 d. 避免3"端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC e. 避免3"端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3"端的错配 g. 避免内部形成二级结构 h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5"端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们 i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意的偏好性,不要在3"端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度(1uM-3uM) j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al. * 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。 设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。 有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。 为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃ 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。 2。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。 3。2．基本PCR引物设计参数 引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。 ①引物长度； 特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。 总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。 ②引物的二级结构 包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。 ③引物GC含量和Tm值 PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃范围内，这可为有效退火提供足够热度。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了Tm值导致特异性的丧失。这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调非常关键。一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好。 ④引物的额外序列与退火温度 若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长的引物。一般说来，引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5’端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。 在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酶的有效切割要求在它们的识别序列的5’端有2至3个非特异的额外碱基，这样就会增加引物的非模板特异序列的长度。长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算，而这对于确定PCR反应时的退火温度又是必须的。对于低于20个碱基的引物，Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。 ⑤引物的3’末端组成 引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个的错配应尽可能的少。如果3’末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。 引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在3’末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。 引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。 需要注意的是，引物3’末端应尽量避免T。实验证明，以T结尾的引物即使与T, G或C错配仍可有效延伸。 ⑥PCR产物的长度及在耙序列内的位置 所有的计算机程序都提供对PCR产物长度范围的选择。一般说来，PCR产物长度对扩增效率有影响。特定的应用情况下，PCR产物长度部分取决于模板材料。 预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。若目的是建立测定特异片段的临床检验方法，120～300bp的小扩增产物可能是最好的。产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。 其他PCR方法有不同的最佳产物长度。例如，通过定量的RNA-PCR检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。这些产物一般在250～750bp范围内。 ⑦补充说明 若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在mRNA的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像3’末端非编码区域与许多其他mRNA有同源性；第二，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。 若PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列，产物的大小是根据具体应用预选的。在这里，计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息。 在选择用来扩增来自不同物种DNA的引物时，应避开mRNA的5’和3’末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何的同源性。谢谢大家退火温度最重要先确定最适合的退火温度再调节反应体系，每升两个温度扩增一次一天可以确定温度了，如果有上十次没扩增出来，快换引物，
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1． 我们引物合成报告单上的所有数据都是由软件系统根据同一组原始数据自动计算生成的。报告单里包含每条oligo的分子量、OD数、每OD的nmole数、两种离子浓度下的TM值、GC含量等参数信息。所以该编号Oligo DNA的实际序列与引物合成报告单上打印的完全一致。如果打印序列与你的定单不同请立即与我们联系。
2． 我们使用对Oligo DNA进行定量。在1cm光程260nm波长下的吸光度（A值），即为1mL该溶液中含Oligo DNA的OD数。根据文献数据，1OD260的单链寡核甘酸大约相当于33ug，但受碱基组成的影响较大。我们通过软件为每条寡核甘酸提供了更准确的nmol数。
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3． TM值的选择。
我们提供两种[Na﹢]当量离子浓度下的TM值。典型体系的[Na﹢]当量浓度一般在0.2M-0.5M之间。普通PCR反应建议第一次摸索条件时使用0.05M[Na﹢]当量下上下游引物的TM平均值；如果用于接头退火建议使用1M[Na﹢]当量下的TM值。
4． 引物合成中的耦合效率(Coupling Efficiency)是根据合成最后一个碱基时脱下来的DMT保护基的量与合成第二个碱基时脱下来的DMT保护碱基的量的比值计算出来的。它反映的是一个平均耦合效率。引物原始质量的好坏主要体现在这些合成和氨解的化学反应上，如果这些步骤出了问题，一般的纯化都将无法弥补其造成的影响。
5． 高质量的DNA应该是呈透明的薄膜状附在离心管底部或管壁。也有少量为白色粉末（跟序列有关）。开盖溶解前请先离心，避免损失。我们推荐用螺旋管装盛引物，这样能避免压盖管开盖带来的损失。
6． Oligo的稀释与保存。我们普通PCR引物的建议溶解浓度为10uM(10pmol/ul)，反应浓度为0.2uM(0.2pmol/ul)。稀释到10uM浓度需加（或者双蒸水）的体积（ul）=每管的OD数*nmol/OD*100。常规引物在干粉状态下能-20℃保存一年。
7． 关于PCR反应体系。建议配合使用我们公司提供的，能使您的实验达到最佳效果。
8． 荧光标记的稀释与保存。FAM、FITC、HEX、TET、cy3、cy5等对光敏感的基团，在运输和使用过程中应尽可能避光保存。cy3和cy5标记的引物在碱性条件下容易降解，所以此类引物不宜用TE溶液溶解，应于中性条件下-20℃避光保存。
9． 我们提供的Oligo DNA的5’端和3’端均为羟基，若需要磷酸基团的必须另作处理。
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14． 常用简并碱基代码：
引物合成常见问题
引物合成的过程？引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
(1)&&& 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH；
(2)&&& 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反应；
(3)&&& 封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；
(4)&&& 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。
Q2.引物合成如何处理？
切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。
纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。
定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。
储存：分装抽干。
Q3.合成的引物5’端是否有磷酸化？
合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5’端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5’或3’端进行磷酸化，需要另外收费。