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【求助】质粒双酶切电泳图长成这样切胶纯化后能做连接吗
楼层直达：
这个帖子发布于4年零193天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家能不能帮我看看这张质粒双酶切的电泳图，上方边缘怎么会这么毛糙，本来是要切胶纯化后作插入目的片段的，怕会影响后面的连接，所以没纯化！已经出现两次同样的状况了，之前做的时候都还是很干净的一条带，不知道是怎么回事啊！载体是pGL3-Basic，酶切位点Mlu I和Xho I，酶切2小时后，1%琼脂糖凝胶电泳，80v电压45min。大家快来帮帮我吧
不知道邀请谁？试试他们
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我最近也在做双酶切连接，做了好几次都出不来，我的问题是酶切片段的亮度和你的Marker差不多，酶切之后还放了一天才做的，也不知道这次能不能做出来。你的胶本身就不是很好吧，要不怎么Marker都是歪的，再跑一次试试，另外一个可能是纯化不干净
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哦，弄错了，不好意思！你的质粒提取出来有没有跑电泳啊？
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没酶切的质粒之前跑过电泳，条带很干净，我是怕会不会是酶的问题，我后来又酶切了一次，情况一样，我就将就把酶切产物纯化了，死马当成活马医，今天转化，看明后天的结果如何了
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关于丁香园质粒酶切求助！
质粒酶切求助！
请问高手关于酶切方面的问题，
是这样的：
我做的是质粒双酶切，每个酶单独切的时候都能很好的切成线性（条带跑得慢）
为什么我双切的时候，老切不开
小片段的条带很糊，根本看不出明显的条带（感觉前面那条带都有点糊）
大条带也很宽！
无论是双酶切，还是单酶切（分开切）我都试过了
酶切的设计方面应该没问题，都是单切点
请问，想上面这种情况最可能是什么问题
我也遇到这样的问题,我打算不双酶切了,分步酶切算了,就多个切胶回收和柱纯化.免得每次郁闷.
楼主有图吗？
双酶切的缓冲液是按照试剂说明使用的吗？结果不好的话就像楼上说的那样分步酶切回收再酶切吧，注意顺序不要搞错
你的小片段 有多小？大的有多大？差距很大吗？
小片段切下来也就几十bp吧,这样的片段能看见么跑胶?我没有看到过哦.
双切得难处主要在于两种酶共用的缓冲液不好选取，请楼主再检查一下你用的两种酶的共用BUFFER，同时还要注意反应条件。我也经常做双切，楼主的情况我也遇到过。出现这样的情况往往是切不全，导致复杂的缠绕物产生，所以出现了弥散或模糊的情况；另外也有可能是酶出现了星号活性，导致复杂的产物产生。
所以，可以尝试优化反应条件，如加大酶量，加大质粒浓度，缩小反应体积等方法。。实在不行，则可以一步一步切，不过要加大量，否则，最后回收的浓度可能就很小了
两个酶单酶切都能切开那证明载体上的这两个酶切位点是没有问题的,所以分步单酶切理论上不存在切不开的问题.
我觉得楼主不要看那个几十bp的小片段了,也不能拿这个说事儿,你连一把试试看.不放心的话可以载体去鳞酸化.
多做几个对照,我也是今天下午才克隆出来,半个月了才克隆好.就是分步酶切然后切完加热失活,再加入1ul的SAP,去鳞,最后是用柱纯化的.
目的片段是双酶切后柱纯化,连接转化,挑了10个,全是阳性克隆.
我只怕你切开了你也不知道。
小片段模糊是很正常的，比如10kb的质粒，切下来1kb的目的片段，剩余载体为9kb，电泳上样100ng的时候，大片段为90ng，小片段仅有10ng，如果你上样量太少，再加上跑电泳的时间没控制好，经常是看不到小片段的，想知道有没有切开，一是加大上样量，另是做电泳的时候将酶切的质粒和没切的质粒放在一起电泳，通过对比就可以看出来了的翻译结果:
查询用时：4.029秒
&在分类学科中查询
METHODS:The IκBαM gene(203-1 003 bp)was acquired by positional cloning,followed by subcloning it into pShuttle and pGEM-T vectors for further PCR,double digestion,DNA sequencing and homology analysis.
方法:PCR定点克隆IκBαM基因(203-1003bp),亚克隆至pShuttle和pGEM-T,进行PCR、双酶切、DNA测序和同源性分析。
Results TheΔNp63-shRNA expression plasmid was confirmed by using PstI +SalI double digestion and by sequencing.
结果经PstI+SalI双酶切及测序鉴定△Np63-shR- NA表达质粒构建成功。
The cDNA of VP7gene was inserted into pMD18_T vector and was identified by sequencing, single and double digestion using HindⅢ, HindⅢ and BamHⅠ.
将其插入pMD18_T载体中 ,构建了重组质粒pMD18_T_JL94 /VP7,并对其进行了HindⅢ ,HindⅢ和BamHⅠ的单、双酶切初步鉴定及其核苷酸序列测定 ,证明pMD18_T_JL94 /VP7中的插入基因为轮状病毒的VP7基因。
The PCR products and pComb3 were ligated after purification and double digestion, and electrotransinfection was conducted with final 2.48×107 transforming ratio under the condition of 2.5 kV, 200 Ω, 25 μF.
PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接,在2.5 kV、200 Ω、25μF的条件下电转化,转化率为2.48×107。
METHODS: The experiment was completed in the Department of Occupational Hygiene of the Third Military Medical University of Chinese PLA between May and September 2003. After double digestion of pUMVC3-hFLT3 with SalⅠ and glⅡ, the product sequence (0.8 kb), was subcloned into the BglⅡsite of plasmid pIRES2-EGFP.
方法:实验于在第三军医大学劳动卫生教研室完成。 先用SalⅠ和BglⅡ双酶切pUM VC3-hFLT3配体,得到全长的人FLT3配体序列(0.8kb),两端抹平后克隆至pIRES2-EGFP载体的BglⅡ位点。
8.8 Kb and 1.2 Kbp visible fragments were obtained during double enzyme digestion of EcoR I and BamH I.
而EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切时,可得到8.8Kbp和1.2Kbp两个可见片段。
Results: The correct structure of the ScFv-Ga14 fusion protein and the plasmid pEBAF/tk-GAL4rec was confirmed by double enzyme digestion, SDS-PAGE and sequencing.
结果 双酶切鉴定及SDS-PAGE电泳证明非病毒转移载体anti-TfR ScFv-GALA融合蛋白及重组pEBAF/tk-GAL4rec真核表达质粒构建成功。
Methods Gene diagnosis using Southern blotting with the p13E-11 probe following EcoRⅠ-BlnⅠ double enzyme digestion was performed in 50 cases of FSHD patients who belonged to 33 unrelated families, comprising 38 familial and 12 sporadic cases. The 10-grade clinical severity scale was adopted. The correlation between EcoRⅠ-BlnⅠ/p13E-11 fragment size and clinical severity scale was tested by Spearman's rank correlation test.
方法对来自33个无关家系的50名临床诊断FSHD的患者进行EcoRⅠ+BlnⅠ双酶切基因诊断以及临床表型评分,应用Spearman秩相关方法分析FSHD1A基因诊断的EcoRⅠ+BlnⅠ/p13E-11DNA片段大小与临床表型评分之间的相关性。
Results Two combinations of double enzyme digestion, SgfⅠ and SacⅠ、XbaⅠ and NotⅠ, as well as sequencing verified the vectors containing targeted gene in specific sites.
结果 Sgf Ⅰ和Sac Ⅰ、Xba Ⅰ和Not Ⅰ两种组合的双酶切及特定引物测序均证实载体构建成功。
Methods TCRγV_1 rearrangement gene containing Xba I and BglII endoenzyme sites was obtained using PCR ; double enzyme digestion was conducted for vector VR1012 and PCR product of TCRγV_1 Both fragments were connected using ligase and transferred to E.
方法　用PCR法扩增含XbaI与BglII酶切位点的TCRγV1基因序列 ,对VR10 12载体及TCRγV1基因PCR产物经双酶切 ,用连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌DH5α ,对重组质粒经序列测定 ,称VR10 12 /TCRγ。
Methods pEGFP-C2-GAD67 and pcDNA3.1-GAD67 were identified by PCR, and confirmed by double restriction enzyme digestion and sequencing.
方法以PCR、双酶切及测序鉴定pEGFP-C2-GAD67和pcDNA3．1-GAD67重组子;
Results The cDNA fragments of about 1 800 bp were amplified by PCR from pEGFP-C2-GAD67 and pcDNA3.1-GAD67, respectively, which were confirmed by double restriction enzyme digestion and DNA sequencing.
结果pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3．1-GAD67均可扩增出约1 800bp目的条带,经双酶切和基因测序证实。
The resulted pcDNA3.1(+)/hHSP90β plasmid was verified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.
将PGEM-hHSP90β及pcDNA3.1(+)质粒经AflII和Xbal双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,构建hHSP90β真核表达载体pcDNA3.1(+)/hHSP90β。
The levels of p53 were analyzed by Western Blot after transfecting osteosarcoma cells with pGL3-mhTERT-shP53. Results
Restriction enzyme digestion and DNA sequencing results verified that the sequences of pGL3-mhTERT-shLuc and pGL3-mhTERT-shP53 were consistent with that we have designed.
使用pGL3-mhTERT-shp53不同的人骨肉瘤细胞,利用Western Blot分析转染前后p53的表达水平。 结果:双酶切鉴定和DNA测序证实pGL3-mhTERT-shLuc和pGL3-mhTERT-shp53的序列与设计完全一致。
The recombinant plasmid pcDNA3.1(-)/ALK-1 was transfected into HEK293 cells after it was verified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.
将ALK-1 cDNA克隆至pcDNA3.1/myc-His(-),双酶切鉴定并测序后,转染HEK293细胞.
The results of several reactions during AFLP analysis have been detected such as DNA extraction,double enzymes restriction,adapter
ligation,pre
amplification,labeling and selective amplification.
对其分析过程中 DNA提取、双酶切、连接、预扩增、标记和选择性扩增的效果进行了检测。
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) analysis system was established with four pig species. The results of several reactions during AFLP analysis have been detected such as DNA extraction, double enzymes restriction, adadpter ligation, preamplification and selective amplification .
以大白等 6个猪品种为试验材料 ,建立了家猪扩增酶切片段长度多态性 (AFLP)分析体系 ,对其分析过程中DNA提取、双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染效果进行了检测。
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小鼠次级淋巴组织趋化因子基因的克隆及真核表达载体的构建 ˇ
作者：陈兴 于继云 修冰水 徐洲稳
【关键词】& ,趋化因子,次级淋巴组织趋化因子,基因克隆,真核表达载体
　　【摘要】 目的 克隆小鼠次级淋巴组织趋化因子（Secondary Lymphoid-tissue Chemokine，SLC）基因，构建真核表达载体。方法 用逆转录聚合酶反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法从C57BL/6小鼠脾脏淋巴细胞中克隆出小鼠SLC基因，再连接到pGEM-T easy载体上并转化至JM109感受态菌中构建成pGEM-T easy-mSLC质粒。先用限制性内切酶Nhe I/EcoR V双酶切质粒pCI/GPI-Fc-Sig和pGEM-T easy-mSLC，构建pCI/GPI-Fc-mSLC中间质粒，再用Nhe I/Not I双酶切质粒pCI/GPI-Fc-mSLC和pcDNA3.1，构建成pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc真核表达载体。转化产物通过PCR扩增筛选、双酶切鉴定，将得到的阳性克隆进行序列测定分析。结果 克隆出的mSLC基因经测序完全正确。PCR、双酶切及测序结果均证实构建的真核表达载体中已插入402bp的SLC的基因片断。结论 小鼠次级淋巴组织趋化因子基因成功克隆，真核表达载体pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc构建成功，为进一步转染真核细胞建立稳定的转染表达细胞株和开展免疫基因治疗奠定了基础。&&& 　　关键词 趋化因子 次级淋巴组织趋化因子 基因克隆 真核表达载体&
　　Chen Xing，Yu Jiyun，Xiu Bingshui，et al. &&& 　　Beijing Institute of Basic Medical Science，Beijing100850. &&& 　　【Abstract】 Objective To clone mouse Secondary Lymphoid-tissue Chemokine（SLC），then construct the eukaryotic expression vetor of mouse SLC gene.Methods Totol RNA was extracted from the spleen tissue of a C57BL/6mouse by TRIzol reagent，the mouse SLC gene was cloned by reverse transcription-polymerase chain reacˉtion（RT-PCR）.Plasmid of pCI/GPI-Fc-Sig and pGEM-T easy-mSLC were digested by Nhe I/EcoR V to construct the intermedia plasmid pCI/GPI-Fc-mSLC for obtaining suitable multiple cloning site.pCI/GPI-Fc-mSLC and pcDNA3.1were further digested with NheI/NotI to construct recombinant pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc.The recombinants were screened by PCR，indentified by enthen positive clone was identified by sequencing.Results The nucleotide sequence of positive recombinant vector was completely correct.The402bp inˉserting fragment was comfirmed by both PCR method and endonuclease digestion.Conclusion The SLC gene was cloned from the C57BL/6mouse spleen tissue lymphocyte.The mouse SLC gene eukaryotic expression vector pcDˉNA3.1-mSLC-GPI-Fc was successfully constructed，and it set up the basis of the transfection of the eukaryotic expression cell and the further research in gene therapy.&&& 　　Key words chemokine Secondary Lymphoid-tissue Chemokine（SLC） gene clone eukaryotic expression vector&&&&&& 　　次级淋巴组织趋化因子（Secondary Lymphoid-tissue Chemokine，SLC）是一种参与体内淋巴细胞归巢的趋化因子，它对体内包括T细胞、B细胞、NK和DC细胞在内的多种免疫细胞具有趋化作用 ［1］& 。由于上述免疫细胞在抗肿瘤的免疫应答方面起着关键作用，所以，克隆小鼠SLC基因并构建真核表达载体，对于进一步探讨小鼠SLC在真核细胞中的表达以及在未来肿瘤基因治疗研究中的应用，都具有重要意义。&&& 　　1 材料和方法&&& 　　1.1 材料 C57BL/6小鼠，♀，7～8周龄，购自军事医学科学院实验动物中心。真核表达载体pcDNA3.1、感受态菌JM109、质粒pCI/GPI-Fc-Sig均为本实验室保存。pGEM-T easy vector试剂盒、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、dNTP购自Promega公司。Trizol RNA提取试剂盒、SuperScriptIII逆转录试剂盒购自Invitrogen公司。质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒为北京博大生物公司产品。限定性内切酶均购自美国BioLabs公司。引物由北京三博生物技术公司合成。DNA测序由上海博亚公司采用ABI310全自动DNA测序仪完成。&&& 　　1.2 方法&&& 　　1.2.1 小鼠SLC基因的克隆 根据GenBank小鼠SLC基因序列设计特异性引物，上游引物为:5’-CTCA GCTAGC ACCATGGCTCAGATGATGAC 3’（含Nhe I位点）;下游引物为:5’-GTTC GATATC TCCTCTTGAGGGCTGTGTC 3’（含EcoR V位点）。用Trizol RNA提取试剂盒提取C57BL/6小鼠脾脏组织淋巴细胞中的总RNA，再用SuperScriptIII逆转录试剂盒将上述总RNA中的mRNA逆转录成cDNA，并以其作为模板，应用上述合成的特异引物做PCR，扩增小鼠SLC基因。PCR反应条件为:预变性94℃5变性94℃30s、退火58℃30s、延伸72℃1min。共35个循环。将扩增产物插入pGEM-T easy载体，构建重组质粒pGEM-T easy-mSLC，由上海博亚公司完成插入片段序列的测定。　　　　1.2.2 真核表达载体的构建及鉴定 先用限制性核酸内切酶NheI/EcoRV分别双酶切质粒pCI/GPI-Fc-Sig和pGEM-T easy-mSLC，分别切胶回收约7400bp的pCI/GPI-Fc片断和402bp的mSLC基因片断，在T4DNA连接酶作用下，16℃连接过夜，构建成pCI/GPI-Fc-mSLC重组质粒。再用NheI/NotI双酶切质粒pCI/GPI-Fc-mSLC和pcDNA3.1，切胶回收约2000bp的GPI-Fc-mSLC片断和已暴露NheI/NotI两个酶位点的质粒pcDNA3.1线性片断，通过T4DNA连接酶连接，16℃过夜，连接产物转化至JM109感受态菌，最后用下列方法进行筛选:挑取菌落，提取质粒后做PCR鉴定（扩增条件同基因钓取）、NheI/NotI双酶切、NheI/EcoR V双酶切和mSLC序列测定，最终确定已含有mSLC基因片断的真核表达载体pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc构建成功。重组质粒构建策略如图1。
　　2 结果&&& 　　2.1 小鼠SLC基因克隆 自小鼠脾脏淋巴细胞中，经RT-PCR方法钓取小鼠SLC基因，电泳结果约为400bp左右，连接pGEM-T easy载体后，转化至JM109感受态菌，得到 23个克隆，随机筛选6个克隆，经菌落质粒PCR及NheI/EcoRV双酶切初步鉴定获得一株基因片段为400bp左右的克隆，再经DNA测序仪精密测序得到它的准确序列，通过在NCBI网站上Blast比对，发现所得序列完全与GenBank公布mSLC序列相同，证实这个基因确为小鼠SLC基因（图2）。
　　图1 真核表达载体pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc 构建流程（略）
　　图2 小鼠SLC基因序列图（略）
　　2.2 真核表达载体pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc的构建 按照方法1.2.2先将测序正确的mSLC基因与质粒pCI/GPI-Fc-Sig连接构建成pCI/GPI-Fc-mSLC载体，再经NheI/NotI双酶切后与pcDNA3.1质粒构建成pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc真核表达载体。转化至JM109感受态菌后筛得阳性菌，用mSLC特异引物做菌落的质粒PCR扩增出400bp左右的特异条带（图3）。用NheI/NotI双酶切，可切得约5.4kb和2kb的两条带（图4），其中2kb条带为mSLC-GPI-Fc片断;用NheI/EcoRV双酶切可获得约7kb和400bp的两条带（图5），其中分子量在400bp位置的条带为mSLC，初步证明插入基因正确。利用末端终止法测序，发现克隆的基因完全与网上mSLC碱基序列相同，故此进一步证实了真核表达载体pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc已成功构建。
　　图3 mSLC阳性克隆PCR结果（略）&&&&& 　　注:1.pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc质粒PCR产物&& 2.Mark DL-2000
　　图4 NheI/NotI酶切pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc 鉴定结果图谱（略）&&&&& 　　注:1.pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc质粒经NheI/NotI&& 双酶切产物;2.Mark DL-2000&&& 　　图5 NheI/EcoRV酶切pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc 鉴定图谱（略）&&&&& 　　注:1.pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc质粒经NheI/EcoRV&& 双酶切产物;2.Mark DL-2000&&& 　　3 讨论
　　次级淋巴组织趋化因子（SLC）作为一种在细胞免疫过程中发挥重要作用的细胞因子已经越来越受到人们地重视，自1997年Nagira M首次发现SLC ［1］& 到现在的短短几年间，国外学者已经有研究证实了SLC在抗肿瘤免疫中的作用 ［2］& ，研究发现，SLC趋化的靶细胞是机体抗肿瘤免疫应答的主要效应细胞，在NK细胞、T细胞和DC细胞表面均表达SLC的受体CCR7，因此，SLC可以趋化这些效应细胞向 肿瘤局部迁移、浸润，从而起到明显的抗肿瘤作用 ［3～5］& 。所以，我们疫苗工程研究室克隆出的全长编码序列的小鼠SLC基因具有重要实际意义。构建出的小鼠SLC真核表达载体pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc可成功用于肿瘤基因治疗疫苗的研究中，为下一步转染肿瘤细胞系制备肿瘤疫苗打下坚实基础。&&& 　　我们此次构建的真核表达载体具有独特之处，在这个载体上插入了锚定蛋白基因GPI和人IgFc段基因，这些基因的插入将在未来真核细胞膜表达以及疫苗制备工程中起到重要作用，其中GPI锚定蛋白的作用是对细胞表面进行修饰，通过GPI-锚定蛋白转移技术可以将与肿瘤免疫相关的多种细胞因子或抗原分子修饰锚定于肿瘤细胞表面，这样可以提高肿瘤疫苗的免疫原性 ［6］& ;人IgFc段基因表达蛋白以后，可以此作为标志，通过细胞免疫荧光染色的方法证明插入基因在真核细胞的表达。此真核表达载体的另一可取之处在于，在插入mSLC的NheI/EcoRV两个酶切位点位置上，可以替换为其他细胞因子基因如具有抗肿瘤活性的IFN-γ、IL-2、B7、IL-12等，这样可能在今后肿瘤疫苗工程研究中发挥多种细胞因子协同作战的重要作用。
　　参考文献&&&& 　　1 Nagira M，Imai T，Hieshima K，et al.Molecular cloning of a novel huˉman CC chemokine secondary lymphoid-tissue chemokine that is a poˉtent chemoattractant for lymphocytes and mapped to chromosome9p13.J Biol Chem，（31）:.&&& 　　2 Nakahara K，Sakata T.Augnented antitumor activity of a secondary lymphoid-tissue demokine（SLC）-interleukin2fusion protein in mouse.J Gene Med，）:463-471.&&& 　　3 Alt C，Laschinger M，Engelhardt B.b Functional expression of the lymˉphoid chemokines CCL19（ELC）and CCL21（SLC）at the blood-brain barrier suggests their involvement in G-protein-dependent lymˉphocyte recruitment into the central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis.Eur J Immunol，）:2133-44.&&& 　　4 Chan VW，Kothakota S，Rohan MC，et al.Secondary lymphoid-tisˉsue chemokine（SLC）is chemotactic for mature dendritic cells.Blood，）:.&&& 　　5 Wyant TL，Smith PC，Brown B，et al.Whole blood microvolume laser scanning cytometry for monitoring resting and activated platelets.Platelets，）:309-318.&&& 　　6 PolosoN，Nagarajan S，Bumgamer，GW，et al.Designer cancer vaccine sma-deeasy:protein transfer of immunosti mulatory molecules for use in therapeutic tumor vaccines.Frontiers Bioscience，0-775.
　　（收稿日期:）&
　　ˇ 基金项目:国家863计划资助项目［］&&& 　　作者单位:100850北京军事医学科学院基础医学研究所疫苗工程研究室&
　　（编辑莉 莉）
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