大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
方法一： 细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。 用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌
细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。
用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。操作过程简述如下。
　　1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值&0.4。
　　2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。
　　3．于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。
　　4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
　　5．以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。
　　6．于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。
　　7．倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
　　8．每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。
　　9．用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200&l转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积&10&l，DNA&50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。
　　10．将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。
　　11．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。
　　12．每离心管加800&lSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
　　13．将适当体积（每个90mm平板可达200&l）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。
　　14．将平板置于室温至液体被吸收。
　　15．倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。
CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/&g，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。
准备工作：
1． 从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37度过夜至长
出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5ml LB培养基中，37℃，250rpm，
过夜培养。
2． 次日从5ml LB培养物吸取200&l转入50ml LB培养基中（250ml 锥形瓶），37
℃，250rpm培养2小时，此时OD600约0.4&0.5。
感受态细胞的制备：
3． 吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。
4． 加入100&l预冷的Solution A，悬浮菌体，冰浴30分钟。
5． 此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。
细胞转化：
6． 在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA，混匀，冰浴30分钟，然后42℃ 1分钟热
击，再次冰浴2 分钟。加入0.9ml LB 培养基，20&l Solution B，37℃，振荡
培养1小时。
7． 取适当菌液（100-200&l）涂布相应抗性的平板。
8． 过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。
补充说明：
1． 所用器具一定要清洁；
2． 操作步骤2 中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml 锥形
瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基；
3． 在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2 ，效果会更好一些；
4． 为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要高于0.6；
5． 制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作；
6． 细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB，简化操作
步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。
1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜
2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0.3
3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴10min。
4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液
5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min
6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去上清液
7、将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。
（1）将1ml过夜培养的细菌（如DH52、TG1、TM101）接种于100ml2&YT培养于500ml烧瓶。于37℃刷烈振荡，通常&200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2～0.5(5&107cells/ml),需2～4h。
（2）将培养物放于冰上致冷10min，于4℃离心细菌培养物，10000rpm离心10min。
（3）弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半（约50ml）的50mMCaCl2和10mm Tris&HCl（pH8.0）无菌冷冻液体中。
（4）将细菌悬浮放在冰上约5min，然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。
（5）弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTris&HCl（pH8.0）无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。200&l分装于无菌的1.5ml微量离心管中，贮存于-80℃冰箱中。
方法五：TSB法（也是本人热衷的方法）
1.药品制备
1M Mg2+ (1M　MgSO4 和 1M MgCl2等体积混合)，用0.22um滤膜超滤除菌。
TSB液（30mL/ 80mL菌液）（现配现用）：
PEG3350　　 3g
Tryptone 0.3g
Yeast extract 0.15g
以上 1210C, 15min 灭菌后，加入1M　Mg2+600uL , 以及DMSO 3mL
（1）活化菌株
（2）挑单菌落培养于5mL　的液笨培养基中
（3）取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养
（4）370C培养3－4小时，OD600在0.4－0.6
（5）离心，去上清
（6）加入20mLTSB，重悬
（7）离心，去上清
（8）加入10mLTSB，再加入15－20%的甘油，分装保存
注，整个操作过程均应在冰上进行。所用药品均需灭菌。
（1）取出200&l感受态细胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或连接反应混合物，DNA量通常&50mg。用手指弹打试管10次，使之混匀，然后放在冰上40～45min。
（2）将管放于42℃水浴中2min。
（3）然后每管直接加入1.0ml2&YT培养基，倒置混匀，并于37℃培养8～12h，干浴或水浴，不需振摇。此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。
（4）每200&l转化混合物分别于6个2&YT琼脂培养板上补充相应抗生素，并含有X-gal（20mg/ml）、IPTG（200mg/ml）。
（5）铺板使细菌混合物干后，倒转平板放于30～37℃培养箱中18～22h。克隆在此期间应该出现，否则转化不成功。
常用的大肠杆菌感受态细胞的制备方法除以上几种外，还有很多。各种方法都各有其优缺点，我们在选择方法的时候应根据自己实验具体情况而定。以期获得最高的转化效率。
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责任编辑：大汉昆仑王0
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标题: 菌种保存问题
摘要: [菌种保存问题] 我现在准备做重组蛋白，因为表达载体很少，想转化一下，自己提质粒。我想问一下保存的问题。首先受体菌增菌后我想保存一下作为以后再用时的菌种，我加终浓度为15%15的灭菌甘油可以吗？直接放-70还是先放-20再放-70？另外载体转化后在平板上的菌落怎么保存？是直接连平皿一起保存还是将菌落刮下放到液体培养基 关键词:[甘油 菌种 质粒 感受态细胞 冰浴 培养液 菌体 载体]……
我现在准备做重组蛋白，因为表达载体很少，想转化一下，自己提质粒。我想问一下保存的问题。首先受体菌增菌后我想保存一下作为以后再用时的菌种，我加终浓度为15%15的灭菌甘油可以吗？直接放-70还是先放-20再放-70？另外载体转化后在平板上的菌落怎么保存？是直接连平皿一起保存还是将菌落刮下放到液体培养基中保存？谢谢各位回复
1. 表达载体很少，那就到转到克隆菌中（DH5a，TOP10等），提一批质粒，用TE溶了，放-80 保存，或者直接保存干粉；
2. 同时保存一份含表达载体的克隆菌。保存菌种时加80 %的 灭菌甘油至终浓度为15 %，先用液氮速冻再放-80度；
3. 平板上的菌落，短时间保存可以放到4度；
4. 如果是表达菌，保存可以，不过冻存的菌做表达，效果可能不是很理想。最好用新鲜转化的菌。
80%甘油应该用什么配置呢？我就是想克隆菌和表达菌活化增菌后都保存一下，因为是和别人要的，都特少，所以想自己保存一下，以后再用时再活化增菌。那么克隆菌和表达菌在未转化之前怎么保存呢？也是加终浓度15%的甘油吗？我是直接加了3的菌液，又加了1的纯甘油，这样可以吗？平板上的菌落长时间保存应该怎样保存？谢谢！
80 %甘油我是用水配置的；
克隆菌和表达菌未转化之前？那就是摇菌保存，和转化的菌保存是一样的方法；
平板上菌长期保存没保存过，个人认为没必要。
1 同意楼上战友的建议。所有的质粒均可以而且最好是转化到宿主菌中保存，很多地方不具备冻干条件，但－70度冻存条件一般都有。个人经验强烈推荐DH5a菌株，觉得从中提取的质粒量大且质优，便于后续操作。
2 加纯甘油或80％甘油都可以，我常用50％的甘油。纯甘油粘度太大，使用不方便，加水稀释后粘度会低很多。
3 保存菌种时，甘油10－15％均可以。最好不要超过20％，有文献报道某些菌种有时甘油浓度太高会造成载体丢失。我一般做10％甘油的，直接取对数生长期的菌液4份，加1份50％的灭菌甘油，混匀就行了。
4 甘油菌种直接－70度冻存就可以了。一般不会有问题。没试过液氮速冻，因为单位上液氮都用于冻动物细胞的，不敢也不许把细菌放进去。
5 不推荐平板保存。容易污染杂菌；菌体易老化。最好不超过2周。
6 保存菌种时注意几点：第一，别污染杂菌，否则后患无穷。第二，标签清楚、记录详细。别图省事，仅用个记号笔在管壁上写写划划。冻存时间久了，字就模糊了。到时候自己都分不清，更 别说后来人了。第三，记住保存的地方。要不然用的时候满冰柜翻，费时费事不说，菌种翻来翻去容易解冻。反复冻融可能就死完了。
个人经验哈。
非常感谢楼上几位热心相助。小女子还有个问题。我一共有两份载体，一份是纯载体DNA，第二份我也不知道是质粒还是含质粒的菌种，两份我将其转化了，过程是：DH5a活化增菌，做感受态细胞，将两份载体分别转入感受态细胞，液体培养基培养后涂板，但那份纯的载体DNA没长，而另一份长了。我重复了两次，同样的结果。这可能是什么原因啊？另外如果第二份给我的是含质粒的菌种，我这样做还会长吗？谢谢！
如果是含质粒的菌种，热激后涂板子，肯定可以长，但不是“转化”的菌，而是原来本身的菌。因为热激不足以释放质粒DNA；
第一个为什么没长，我认为很可能是你的感受态没做好，或者转化过程中出了差错。拿别人的质粒看看你的感受态效率有多高先。
但不是“转化”的菌，而是原来本身的菌。这句是什么意思。
我的实验步骤：
1 DH5a单菌落接种于2mlLB培养液中，37度振荡培养过夜。次晨按1：100转种于5ml LB培养液，37度剧烈振荡培养3小时。从中取1ml置冰浴中冷却10分钟，8000转离心2-3分钟（普通高速离心机未用低温的）收集菌体，沉淀重悬于200ul冰浴冷0.1mol/mlCaCl2中，冰浴20分钟，8000转离心2-3分钟收集菌体，重悬于1mlCaCl2中1小时以上即可作为感受态细胞使用。
2 将2-3ul载体DNA转化感受态细胞200ul，冰浴45分钟，37度热休克5分钟（我看书上都是42度90秒但老师说37度更温和一点），再冰浴2分钟，加入LB培养液500ul，37度振荡培养1小时，200ul涂布于LB平板上（含氨苄100ug/ml）
我重复了两次，平板上干干净净，什么都没长。载体应该没问题，我转化之前跑过电泳加1ul跑的条带很亮，请帮忙给我指导看看什么地方让我失败了。我以前学的不是分子，有些原理不是特别懂。现在实验做的非常不顺利，马上就要毕业了，我很着急，希望大家能帮帮我。谢谢！
周围没人做分子克隆这方面的实验，所以有些事情感觉很棘手。只有这么点儿质粒还是千里迢迢和别人要的，我怎么看我的感受态细胞的效率有多高？谢谢
但不是“转化”的菌，而是原来本身的菌。这句是什么意思。
我的实验步骤：
1 DH5a单菌落接种于2mlLB培养液中，37度振荡培养过夜。次晨按1：100转种于5ml LB培养液，37度剧烈振荡培养3小时。从中取1ml置冰浴中冷却10分钟，8000转离心2-3分钟（普通高速离心机未用低温的）收集菌体，沉淀重悬于200ul冰浴冷0.1mol/mlCaCl2中，冰浴20分钟，8000转离心2-3分钟收集菌体，重悬于1mlCaCl2中1小时以上即可作为感受态细胞使用。
2 将2-3ul载体DNA转化感受态细胞200ul，冰浴45分钟，37度热休克5分钟（我看书上都是42度90秒但老师说37度更温和一点），再冰浴2分钟，加入LB培养液500ul，37度振荡培养1小时，200ul涂布于LB平板上（含氨苄100ug/ml）
我重复了两次，平板上干干净净，什么都没长。载体应妹晃侍猓?易???芭芄?缬炯?ul跑的条带很亮，请帮忙给我指导看看什么地方让我失败了。我以前学的不是分子，有些原理不是特别懂。现在实验做的非常不顺利，马上就要毕业了，我很着急，希望大家能帮帮我。谢谢！
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你提到，可能直接用了含质粒的菌，然后转化你的感受态。而质粒转的没有长菌。所以我认为你的第二管转出来的不是感受态接受质粒后的菌，而是你加进去的菌。
1. 如果是菌，你用的是37度热激，那还活得好好的；
2. 如果是菌，37度不会裂解释放质粒，何来转化一说？
3. 如果是质粒，为什么同样的操作在第一管没菌呢？
不管是什么， 不追究了，长出来了，就提一些质粒留着吧，免得折腾没了。
关于你的感受态制作方法，
1. 我认为冰浴时间可以延长；
2. 8000转没意义的，不知道多少g；反正速度不能太高，能离下来就行；
3. 没用低温？为什么？一定要低温操作；
关于你的热激转化，
1. 从没用过37度，不知道会怎样；
个人意见供您参考。
才开始进行试验，应当按照标准的方法和程序进行。除非你的方法确保是别人重复试验的结果。《分子克隆试验指南》，可为这方面试验的宝典。
下面给你一个我进行这方面试验的方法，由分子克隆上的简化来的。反复试验多次，均可行。希望对你有帮助。
1.感受态细胞的制备
参照《分子克隆实验指南（第三版）》中提供的Inoue方法并稍加修改以制备和保存大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)DH5a的感受态细胞 。方法简述如下：
（1）配制Inoue转化缓冲液
用超纯水配制Inoue转化缓冲液，成分如下：
试剂终浓度注释
MnCl2.4H2O55 mmol/L
CaCl2.2H2O15 mmol/L
KCl 250 mmol/L
PIPES 10 mmol/L（我用MES代替PIPES，效果一样）
KOH 调节pH值到6.7
H2O 定容到相应体积。
配制的Inoue转化缓冲液用0.22um孔径滤膜过滤出菌，分成小份于-20℃冻存。使用前解冻并于冰上预冷。
（2）取实验室保存的DH5a甘油菌，接种至LB培养液中，30、220rpm培养过夜。取上述适量培养物分别接种于LB培养液中，于18-22℃中速摇床培养。随时测量培养物的OD600值（30-60min测量一次），当OD600值达到0.55时，将培养物置于冰上冷却10min。或接种不同的菌体量于LB培养基中，18-22℃中速摇床培养过夜，第二天测定培养物OD600值，将菌体浓度适宜的培养物置于冰上冷却10min，用以制备感受态细胞。
（3）于4℃以2500g离心10min，倒去培养液，收集菌体。用约1/3培养液体积的预冷Inoue转化缓冲液悬浮和洗涤菌体2次，重复离心步骤。
（4）用约1/12培养液体积的预冷Inoue转化缓冲液悬浮菌体，加入DMSO至终浓度为7%。轻轻混匀，放置冰上10min。然后分成小管，每管100－200ul，贮存于-70℃备用。为提高转化效率，冻存时间应不低于12小时。
（5）使用前取出冻存的感受态细胞，冰浴解冻即可。
说明：我们采用这种方法，只要保证－70℃冻存状态完好，制备的感受态细胞可以使用几年。取出就用，很方便的。具体的可以参考《分子克隆》。
2 转化E.coli感受态细胞DH5a
DNA转化参照《分子克隆实验指南（第三版）》并加以适当修改进行，简述如下：
A. 从-70℃冰箱中取出一管DH5a感受态细胞，放冰浴中融化。融化后在冰上放置10min。
B. 取连接反应产物，高速离心10min，小心吸取上清5-10ul加入到感受态细胞悬液中，混匀后冰浴30-60min。
C. 将小管静置于42℃水浴中，热休克60－90秒（不要超过90秒）。
D. 快速将小管转移到冰浴中，静置冷却1-2min。
E. 每管加入800ul LB培养基，置于37℃摇床中，中速摇动培养45min以恢复氨苄青霉素抗性。
F. 取适当体积的上述培养物涂布到含100ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养平皿上，将平板置于室温直至液体被完全吸收。也可先低速离心浓缩菌体，再悬浮涂板。
G. 倒置平皿，于37℃培养，12-16h后观察菌落生长情况。
说明：若转化质粒，质粒量应减少到1ul以下。具体的可以参考《分子克隆》。
再问个问题，感受态细胞保存时，直接分装好放-70就行了吗？不用加甘油了吧？
再问个问题，感受态细胞保存时，直接分装好放-70就行了吗？不用加甘油了吧？ 要加甘油的，否则-70度下感受态细胞就冻死了。你没有甘油，就加DMSO
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大肠杆菌感受态的制备
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即送15丁当
讨论:关于加甘油保护剂的大肠杆菌的复苏方法&[精华]
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这个帖子发布于12年零69天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我想请教各位前辈一个问题，现在我有加甘油冻存的大肠杆菌一批，想把他进行复苏，如何才能把大肠杆菌从甘油中去出来，望各位前辈不惜赐教！
不知道邀请谁？试试他们
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sunrise223 我想请教各位前辈一个问题，现在我有加甘油冻存的大肠杆菌一批，想把他进行复苏，如何才能把大肠杆菌从甘油中去出来，望各位前辈不惜赐教！甘油和水是混溶的，加甘油的目的就是防止或减少菌体在冻冻过程中体内形成冰晶，你把甘油冻存的大肠杆菌在冰上融化以后可以稍微离心处理一下，把上清倒掉，用枪头把菌体悬浮起来然后转接平板或者斜面就可以了。
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我同意主任的看法，不过我建议把离心菌体用培养基洗一次！效果会好一些！试试吧！
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谢谢!不过我认为进行离心有点不现实,因为保存菌种的试管不适合离心机,如果要离心的话得往离心管中加,容易造成不必要的污染，我刚试了一下,直接从甘油中取出若干毫升菌液,接种到斜面和肉汤中,观察结果也还可以,不过就是懒了一点,离心的方法比较科学正规.
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从甘油中取出若干毫升菌液接种到肉汤中，这样可能保存时间长一点的也能活。
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sunrise223 谢谢!不过我认为进行离心有点不现实,因为保存菌种的试管不适合离心机,如果要离心的话得往离心管中加,容易造成不必要的污染，我刚试了一下,直接从甘油中取出若干毫升菌液,接种到斜面和肉汤中,观察结果也还可以,不过就是懒了一点,离心的方法比较科学正规.我们一般把菌体保存在Ependorf管中，所以离心很方便；同时Ependorf管体积小，密封也挺好，不容易染菌。
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保存在Ependorf管中挺好，但就是数量有点少，只适合于实验室的菌种保存，对于生产来说，它的数量有点少，不能满足于生产要求，我们的菌种多是用大试管保存，量比较大，所以要保存到Ependorf管中还是比较困难的。
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取出后置37度几个小时，划平板或液体培养都没问题，我经常反复冻融（但次数不多），对菌均没影响
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就直接吸一点融化的菌液，加到肉汤中培养。浑浊后再划线分纯就行了。那点甘油稀释后没有什么作用的
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另外，菌种保藏，最好当然是冻干保存（除了不适用于冻干的菌），再就是超低温保存，负80度冰箱或者液氮保存，个人觉得最好是用冻存管或者EP管少量冻存（比如0.5毫升），不管是冻存还是融化都快而彻底，效果比较好
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请教大家一个问题：冻存在-80度超低温冰箱的菌液（转化后，用小EP管存，百分之一十五的甘油），我想提它的质粒DNA，请问我应该如何操作呢？
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其实，只要是通过正确方法保存的甘油管，用冰浴融化就行了，混匀，直接用铂耳在平板上划线就可以了得到复苏的单菌落，而且根据菌落的形态，还可以初步判断是否有污染。除非是菌浓度太低，需要增菌后划线。——————————————————请教大家一个问题：冻存在-80度超低温冰箱的菌液（转化后，用小EP管存，百分之一十五的甘油），我想提它的质粒DNA，请问我应该如何操作呢？ ——————————————————我建议还是复苏后再培养，再提质粒DNA。
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我的菌种是加了纯甘油冻存于－80度的，培养基于甘油的比例是9：1，当然甘油一定要高压灭菌。在复苏时，用37－45度水浴时菌种在一分钟内快速融化，以防止溶液缓慢融化形成冰晶对菌种活力造成的可能影响，然后接种于液基中增菌，再画固体平板纯化挑取单个目的菌落于液基中再增菌。个人认为：菌种冻存时的甘油在菌种复苏时并不需要特殊处理使其去掉，因为菌种要纯化，所以那点甘油对细菌并没有影响。不过，我培养的比较特殊，是支原体。（一家之言，仅供参考）
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ljksbs edited on
我们实验室对于冻存管的复苏，都是用液氮直接从－80 度冰箱拿出，不使细菌融化，用烧红的接种环刮一下冻存菌的表面，然后划平板，挑单菌落的。可以参照《分子克隆，实验指南》上的方法。
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甘油1份+含有细菌的培养基3份,负20度保存在Ependorf管中,用时用钓菌环钓一环,接到培养基中进行培养即可.
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菌液+甘油（1:3),保在-80用时不必融化，只需刮点冰屑接种到LB就行了
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我们实验室保存的菌种均是直接从冻存状态接活到液体的培养基中，对菌本身并无影响。
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可以直接取一定量冻存液接种于培养基中，待浑浊后划线分单菌落，没问题的，那一点量的甘油影响不大。
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1.在保存菌种时甘油与菌液要混匀，不然如果直接从冻存状态接种培养基有时会取不到菌。2.如果冻融接种应迅速融化，混匀，因菌体往往沉积于下面。3.接种液体培养基，初次复苏有时菌长得很慢，可以多摇一段时间。4.如果初次接种含有抗生素的培养基不长的话，我们的经验是可以先用不含抗生素的液体培养基，等菌长后，再转种于含有抗生素的培养基中。
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不知道菌种和甘油混合后置于-130度冰柜存活期、存活数怎样?放于-60度冰柜与-70度相比存活数及存活期如何?
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你的大肠杆菌中的甘油影响你什么啦??????甘油本身是大肠杆菌的一种碳源,有必要那么大张旗鼓的去除他吗?????我通常都是直接使用甘油菌,一点也不影响嘛!!!!!!!!!!!!!!
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