免疫组化实验方法_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
免疫组化实验方法
上传于||暂无简介
阅读已结束，如果下载本文需要使用1下载券
想免费下载本文？
下载文档到电脑，查找使用更方便
还剩2页未读，继续阅读
你可能喜欢免疫组化技术的前言_百度知道
免疫组化技术的前言
我有更好的答案
百度知道提示您：该问题下回答为网友贡献，仅供参考。
05Tris—HCL缓冲液PH7，既先形成PAP复合物→抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物、镜检，灵敏特异，随时可取，入PBS，显示不均：注意温度与时间的关系：以ABC复合物代替PAP复合物，室温5~30分钟，30 分钟.jpg" esrc="http，而后再结合PO 。3．水洗，其上有4个与生物素相结合的位点.com/zhidao/wh%3D600%2C800/sign=2d7f1f52d33f28e22b22cc/a6efce1b9d16fdfa106b3a04b38f8c，与其他种属间无 交叉。—— 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术.3%H2O2 （在PAS或0。（2）染色稍浅亦可拿出、功能代谢综合研究的
一项有力工具，室温。▲ 染色失败的几种原因，放大倍数↑://h。对照切片呈阳性结果，称阴性对照：① 直接法② 间接法③ 多层法（3）按标记物的性质分成，1∶1500试验。11．0。（2）温度与时间 4℃。分子量小。5．滴加第一抗体.jpg" target="_blank" title="点击查看大图" class="ikqb_img_alink"><img class="ikqb_img" src="http，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一：过夜.baidu。粘附剂太厚。结果，原因可能是、蛋白A金法） （1）必要性：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate ，使免疫细
胞化学得到广泛应用；④ 底物中所加H2O2 量少或失效。② 减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）（2）方法，否则无可比性。如Ab—I鼠抗人的抗体。——并非Ab浓度越高越好.hiphotos，选用配套的Ab。6．0。3．Ab滴片技术—— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。现在还有plus盒，室温15~60分钟，时间短，洗三次，注意质量和性能、免疫细胞化学分类方法迅速发展，此步可省略，标为阳性对照。—— 70年代 Stemberger 改良上述技术。3．非标记Ab桥法，洗三次。全部（－）原因可能。用新配置的0，将二抗和三抗再重复一次.6中或甲醇中）室 温.com/zhidao/pic/item/a6efce1b9d16fdfa106b3a04b38f8c。其应用范围深达医学各个学科。4．PBS洗涤技术（1）洗涤的目的① 保证离子浓度和PH值://h.baidu：用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，随时镜检（DAB用时新配）13．自来水洗净：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。⑥ 使用全血清抗体稀释不够，或抗体失效，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术。12．DAB—H2O2 显色，每次5分钟；③ 缓冲液内含叠氮化钠：① 未加酶消化处理切片，以防抗体的蒸发和干片， 背景低。② 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确。9．滴加ABC复合物：较直接法灵敏：基本不用，则不能用其他 动物：1．固定剂的选择，应呈阴性结果.hiphotos。<a href="http。③ 漂洗不够。—— 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC）法之后。Biotin 。④ 底物呈色反应过久，则必须具有可视性标记物；② 漏加一种抗体，4℃过液或室温5′~1 hour，或呈色反应时间过长，每次5分钟， PAP法）~ 是桥法的改良。2．封闭内源性过氧化物酶：辣根过氧化物酶.5%甲基绿，胞浆、 ABC法）③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法：无须稀释（2）原液：用0：标本的固定和处理不当，可标记一种抗体→ 鉴定多种抗原：因组织而不同，每次5分钟。2．固定方式的选择；若：工作液浓度为1∶1000。② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异；37℃，一种糖蛋白、封固。④ 关于Ab保存应参照说明书。③ 使用已变色的呈色底物溶液。 1．实验计划① 根据课题的内容选用动物：用确证不含已知抗原的标本作对照，免疫金—银染色法。它有4个亚基可与生物素结合，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察→检测抗
原，若一方过剩则形成复合物小且少：“桥法”是酶标记抗体的改进、免疫金 染色法，在贴片方面最好贴于同一张载片上.com/zhidao/wh%3D450%2C600/sign=cbd5da06e0f064eaadfd/a6efce1b9d16fdfa106b3a04b38f8c。[注意] 滴抗体前需把切片上的水弄干，检测的阳性标本呈阴性反应：灵敏度低，但不能干片，阴性对照 还应包括空白、半抗原标记法，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠。④ 抗体温育的时间过长，每次5分钟。如。（非特异性～细胞与组织无区别）② 染色强度不同，洗三次、免疫电镜
技术相继问世。（4）阳性对照染色良好、胞膜。⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。—— 90年代 分子杂交技术。4．减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清。② 边缘干燥—非特异性染色（常见），可选1∶750进行试验、透明。其他。② 切片或涂片过厚，而后分装10μl/瓶→冻存（-20 ℃）于 冰箱备用。⑤ H2O2 浓度过高。7．蛋白A—金法（Protein—A gold method）~多用于电镜8．双重组化染色法应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片：颜色深浅不一（非特异性染色 弥散性均匀）2．组织切片制作过程的影响① 固定不良—非特异性染色。3．人工假象与特异性结果显示不在同一平面上！2．间接法 荧光素标记在二抗上（二抗。要领。直接法优点，牢不可破、碱性磷酸酶。（1）ABC复合物的制备。（3）所有切片背景过深：（1）所染的全部切片均为阴性结果：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的。15．常规脱水，穿透力↑: 1∶500有背景！），呈色速度过快：（2）ABC法反应原理6．SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染 色）
Streptavidin/peroxidase or strepta- vidin/alkaline phosphatase）※ 该法是ABC法基础上的进一步改良，洗涤不彻底、原位杂交技术，包括阳性 对照在内。——2000年 各种免疫组化技术更加成熟、胞核。阳性对照，1∶1000，或干燥了，使卵白素与链霉（而非生物素）结合：洗三次：① 切片在染色过程中抗体过浓。其实这只是阴性对照中的一种.01%H2O2的DAB溶液。 缺点，加抗体时勿干片，原因可能是，室温最宜5分钟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态。△ 酶标抗体要显示后镜检.baidu。优点是，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。（1）单桥法(2)双桥法在三抗之后：主要应用于免疫电镜，复染胞核（可不染）。5．ABC法（亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法，FITC） —— 荧光显微镜下
呈绿色荧光四乙基罗达明（rho—damine RB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光② 酶。 （1）根据染色方式分成，Avidin—biotin—peroxidase Complex method，入PBS 洗三次/15分钟：简单，成本低：更简便，1∶1000阳性反应稍浅，特异性强，抑制了酶的活性：棕褐色反应产物代表抗原X的定位：① 贴片染色② 漂浮染色（2）根据Ag—Ab结合方式分成。14．用Mayer 苏木素或0：① 免疫荧光技术（免疫荧光法）② 免疫酶技术（酶标抗体法，货源充足。 应用：① 染色未完全严格按照操作步骤进行。阴性对照。③ 选用的试剂可靠：① 浸渍固定（参考文献）② 灌注固定（+后固定）③ 蒸汽固定 1．切片脱蜡入水： 亲和素。★ 特别提示、吸收和抑制实验。※显色后镜检特点，脱水、替代。（3）Ab浓度的选择Ab浓度不可太高或太低、桥法、PAD 法。② 原液的保存（—20℃）冻存——应选最佳稀度冻存、间质具有结构性.1MPBS 洗净；极 过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。ABC法与PAP法的区别是：1．阳性染色特点① Ag定位，若在镜下检测://h，封片后颜色可加深，提高了灵敏度.05M Tris –HCL 5~10分钟。（2）常用标记物① 荧光素：2 h or 参考说明书6．光镜控制显色方法（1）室内操作：① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验，两者亲和力巨大。5．Ab孵育技术（1）必须在湿盒内进行。③ 生物素：（Biotin）④ 铁蛋白金等，ABC 法）Avidin。③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍：甩净组织周围的水.1MPBS： 生物素—维生素H，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用） 1．直接法荧光素直接标记特异性抗体（—抗）上，30分钟，所需抗体量大（不经济）。2．Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液）（1）工作液，经过三次抗体， 可选1∶500，所染标本可长期保存，否则不能连接成复合物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，其二抗为未标记桥抗体。10．0，每次5分钟.1MPBS 洗三次，可增大染色强度：注意动物种属关系4．PAP法（过氧化物酶—抗过氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method。该法简化了操作步骤。8．0，室温15′~ 60′，等电点中性更适合组织。7．滴加第二抗体。9．免疫金—银染色法（Immunogold—silver staining IGSS） 注意事项 ——1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。最常见的原因是。 从以下几 个方面综合评价.hiphotos；⑤ 复染或脱水剂使用不当（2）所有切片均呈阳性反应
向医生提问
完善患者资料：*性别：
其他类似问题
为您推荐：
您可能关注的推广
等待您来回答
下载知道APP
随时随地咨询
出门在外也不愁解决时间: 09:43
(共有<span
style="color:#FF位秀友关注过此问题)
免疫组化技术(IHC)的优点是什么
回答者：匿名用户
&&1．特异性强&免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
2．敏感性高&在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
3．定位准确、形态与功能相结合&该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。
欢迎对最佳答案进行评论或补充，发表您的不同见解！
找到"免疫组化技术(IHC)的优点是什么"相关问题约0篇，用时0.078126秒
生物秀旗下专业的学术问答社区，为生命科学和医药领域的专业人员提供互帮互助的交流平台。秉承“人人为我，我为人人”的互助理念，让给予成为一种生活方式！
联系我们[Contact Us]：E-mail：
电话：021-
关于我们 [About Us]
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT(Biology Technology)的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和相关企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
生物秀旗下 [Website]& 免疫组化技术总结
下载花费:1积分
格式: 大小:243.60K
人气(160) 下载(97)
已有<font color="#FF位谷友通过上传文件赚到了<font color="#FF个积分
资料总积分:
没有下载信息免疫组化技术典型实验案例学习_抗原_中国百科网
免疫组化技术典型实验案例学习
&#160;&#160;&#160;&#160;　　案例一：DAB染色后切片着色一片黄/背景深
　　背景：奥运会期间我们课题组研究生都在实验室做实验，许多从北京购买的试剂买不到，对我们的许多实验产生了很大的影响。我以前一直用中杉金桥的Sp三步法染色试剂盒，效果不错，在奥运会期间我准备做同批实验分不同批次酶免疫组化实验，第一批组化实验结果很好，抗体浓度感觉比较合适（Santa Cruz公司1：200），等做第二批时发现封闭血清不够了，为了保证实验顺利进行，我又从福州迈新顶了一个SP试剂盒，同时抗体稀释液也不够了，我又重新从博士德公司买了一小瓶10ml。从第二批实验开始，组化实验结果一直显示强背景着色，特异性染色很难辨别。
　　问题及其解答：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？
　　1、 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
　　2、 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
　　3、内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
　　4、 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
　　5、 DAB孵育时间过长或浓度过高；
　　6、 PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；
　　7、 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
　　我的实际解决方案：
　　以上的分析可能对于初学者还是不容易的，下面我就把我的排除实验的具体过程与大家进行分享、交流和讨论。
　　1、首先排除抗体孵育条件。一般来说，着色效果的好坏与抗体的孵育条件是密不可分的，由于用SP法已经做出来过一次且效果不错，因此对于同样组织的同一抗原进行分析，这种因素可以先排除。
　　2、其次，DAB孵育时间是否太长？做出来那一次我是孵育8min，后来也是8-10min，我单独做了一次实验来排除该因素。结果孵育2、 5min时先出现背景，而特异性染色较浅，故这不符合常理，一般先出现特异性染色，然后随着时间的延长，会出现非特异性背景着色。
　　3、最后，血清封闭的问题？以前我一般孵育15-30min，所以我单独做了一次实验用血清封闭室温1h，其它条件同做出来的那一次，结果也一样背景着色很深。
　　4、此外，我在改进的同时，也对PBS清洗不断地延长时间和增加次数，甚至完全参照试剂盒说明书来进行操作（我以前一般一抗4度过夜且室温复温 45min、二抗37度30min、Sp反应37度30min），以及过氧化氢灭活加强等等均未起到效果。
　　我冷静地分析了一下整个实验流程，与第一次做出来相比，只有两个地方做了改动：因血清不够而更换了不同厂家试剂盒、因抗体稀释液用完而重新买了抗体稀释液。
　　5、我用PBS替代一抗稀释液（我以前还回收抗体，自我觉得抗体稀释液中含防腐剂和蛋白稳定剂），其它步骤和组织切片完全与第一次做出来的一致（包括血清也是老试剂盒内剩余的一点），奇迹出现了：结果很好。--因为抗原抗体反应除温度、抗原/抗体浓度外，然后就是PH值，于是我测了新抗体稀释液、老抗体稀释液和PBS的PH值，结果是前者偏酸性（&6、0），而后两者均在7、5左右。
　　6、看来主要祸根是抗体稀释液的PH值出问题了，于是我又用PBS替代抗体稀释液和新试剂盒内的试剂对组织切片做了免疫组化，结果还是没有做出来：背景很深。这真把我搞惨了。难道还有什么原因吗？通过仔细分析：一抗一定是结合上去了（老SP试剂盒结果很好），问题是二抗没有结合上去也不对（因为最后背景很深，这说明二抗可能也结合上去了），DAB孵育时间现在只用1、5min也是背景深而特异性染色浅，那我又怀疑封闭血清了。
　　7、我做了两张切片：一张用老试剂盒内还剩下一点的血清而另一张用新试剂盒内的封闭血清，其余试剂（二抗、SP）均用新试剂盒提供的，结果是前一张效果很好，而后一张能够看到特异性染色，但背景太深，拍照效果不佳。--看来封闭血清也是罪会祸首之一。
　　结果分析显示：抗体稀释液的PH值偏低和封闭血清的失效导致了我的免疫组化结果的不佳，望大家在以后的组化实验中也要注意这两个不太引人注意的关键问题。--惨痛的教训，值得引以为鉴。
　　案例二：DAB染色后切片着色呈阴性结果
　　背景：其实免疫组化在DAB染色后一般有四种情况：阳性染色效果很好、阴性染色、非特异性染色很深、阴阳脸（染色不均匀）。而阴性染色是许多初学者经常遇到的头疼问题。我身边有个研究生同学在我们实验室初次涉入免疫组化，听说步骤不难，跟我后面做了几次之后，就自己开始做了，连续做了三次，结果均是阴性染色。很扫兴，不知是什么原因导致的。
　　问题及其解答：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？
　　1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎么这么高稀释度也没能做出阳性结果？另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。
　　2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。
　　3、组织切片本身这种抗原含量低；
　　4、血清封闭时间过长。
　　5、DAB孵育时间过短。
　　6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。
　　7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。
　　我的实际解决方案：
　　1、首先，排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少。免疫组化中两个最重要的因素是抗原和抗体。（1）抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3-6个月，可能切片内的抗原丢失很严重（有文献支持），此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证（蜡块需要低温保存）。（2）石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。（3）组织切片中本身抗原含量的多少？这方面我有教训的，我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定，用1：200一抗效果很好；但我用 1：200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测，几乎呈阴性，后来证实是因为两者抗原含量相差甚远，则一抗也要适当提高浓度。
　　2、其次，检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。（1）一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好；一抗的species reactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。（2）抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议4度孵育过夜和37度复温45min；二抗我一般37度30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。（3）抗体浓度过低。这是阴性结果的最可能原因。必须提高稀释度，我一般初次做一种新抗体，喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次，然后决定是向高还是低方向摸索。一般先决定二抗的浓度（工作液就好办了，直接滴加），重点摸索一抗的最适浓度。注意：免疫反应中存在前带和后带效应，这提示不是浓度越高，阳性率就越高，反之亦然。（4）重要原因排除之后，也不要忽视抗体的质量：原装抗体一般比较稳定，效果较好；而进口分装次之；工作液可能要注意质量问题。
　　3、同时，DAB的孵育时间可能要适当延长，在镜下观察，有时可延长至30min。但一般3-10min最好，此时背景也较浅。否则，说明抗体浓度不合适。
　　4、最后，血清封闭时间也可相应缩短。一般10-30min，但这个时间可以调整，封闭主要是降低切片的总体背景着色。
　　5、此外，细胞通透也不可忽视。许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透，因为切片时可能已经把细胞切开了，但对于胞核蛋白，建议还是通透一下，促进抗体等试剂充分进入参与反应。
　　6、以上原因，都是针对实际中常见原因来进行分析的，前提是排除操作者的操作错误而引起阴性结果，这就需要新手还是要设置阳性对照以排除方法的问题。还有抗体稀释液的PH值过低等其它原因的干扰。
　　总之，要想把免疫组化做好，可能每一个环节都很重要，但也存在主次之分，出现问题了，需要通过先排除主要的，再依次排除次要的--这是衡量你对免疫组化原理掌握与否的关键所在。
　　案例三：石蜡切片免疫荧光染色呈阴性结果或非特异性结果
　　背景：因实验需要，于日初次做肝脏组织ZO-1（一种胞膜蛋白，紧密连接蛋白）免疫荧光染色，以前我对酶免疫组化非常熟悉，在园子内也有不少置顶贴和精华帖，但免疫荧光一直还没做过（原理知道，但细节不太了解）。我先用石蜡切片做了5次，结果一直不理想（表现为未见特异性强染色）；近几日，我又切了冰冻切片，做了2次，终于基本成功了。在这个过程中，我对免疫荧光染色技术有了全新的认识，而前些天发出免疫荧光求助贴，回复的很少，所以有必要加强对免疫荧光方面的讨论），不妥之处敬请指正。有人会问酶免疫组化做的好好的，为何要做免疫荧光？其实，这也是我以前思考的难题，现在我认为可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫组化可能做不出来，需要敏感的免疫荧光方法来进行蛋白检测（我是看许多外文文献都是这样做的，因此选择免疫荧光染色。）
　　问题及其解答：如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色？
　　1、非特异性染色产生原因及其解决方案：
　　（1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。
　　（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
　　（3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。
　　（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
　　（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
　　（6）荧光素不纯、标本固定不当等。
　　（7）一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。
　　（8）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。
　　2、阴性染色产生的原因有：
　　（1）一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥。
　　（2）荧光素提前衰退。荧光素质量不佳或操作过程中没有注意避光等防止荧光素衰退的事项。
　　（3）血清封闭时间过长。
　　（4）抗体稀释液PH值不合适，影响抗原抗体反应。
　　（5）组织切片不平、裂片或脱片很严重，易引起大块阴性着色。
　　（6）组织标本不新鲜或已经冷冻组织制成的切片中抗原易弥散，易引起本来表达的部位阴性染色或弱着色。
　　（7）荧光显微镜不会使用，激发波长选择错误。
Copyright by ；All rights reserved.