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& 日本TAKARA TP700实时荧光定量PCR仪
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产地：日本
TP700实时仪特点：
■ 制品说明
Thermal Cycler Dice Real Time System Lite(Code No.: TP700)装配了一块标准的48孔反应模块，其激发光源为LED光源，检测装置为CCD摄像头，不仅性能十分而且操作也非常便捷，完全可以满足个人实验的需要。
采用Peltier作为温控元件，可进行稳定的温度调控，检测系统中的摄像头从48个反应孔的上方同时检测荧光，从而没有孔间测定时间差。温控系统和检测系统地完美结合，实现了样品孔间的高度均一性和定量结果的可重复性。荧光通道的标准配置是FAM/SYBR Green I和ROX/Texas Red两种检测通道，通过对SYBR Green I及各种的检出可进行Real Time PCR，而且可以利用FAM和ROX检测通道进行多重实验。另外，也可以选择增加2个检测通道(HEX/VIC通道和Cy5通道)。
从实验开始到结果分析，初学者也可以顺利地完成实验操作。根据研究人员的不同需求，可以选择多种不同的方法进行实验结果的分析，而且不同的分析方法之间可以一键切换。
Thermal Cycler Dice Real Time System Lite MQR(Code No.: TP760)是一种配置了相对定量解析软件「Multiplate RQ」，可进行多通道检测的实时荧光。Multiplate RQ软件是根据Real Time PCR实验的反应次数增多、需要几个参照基因校正进行准确定量而研发的相对定量解析软件。可方便地对多个检测样品、多个基因进行相对定量解析。
■ 仪器特点
◇ 温控元件与光学系统&Thermal Cycler Dice Real Time System Lite采用Peltier作为温控元件，可以稳定地控制温度变化。同时，检测系统中的摄像头从48个反应孔的上方同时检测荧光， 从而没有孔间测定时间差。温控系统和检测系统的完美结合，实现了样品孔间的高度均一性和定量结果的可重复性。
◇ 操作简单、直观&软件的用户操作界面主要由五种功能窗口组成，整体简洁直观，功能全面。同时适用于初学人员和专业人士。
◇ 小巧的机身构造和标准的48孔反应模块&Thermal Cycler Dice Real Time System Lite的机身比前几代的机型都小巧很多，但样品模块的操作方法没有改变，其适用的48孔板与常见的96孔板相比，孔间间距及规格也是相同的。
◇ 多种解析方法&可以选择多种不同的方法进行实验结果的分析，而且不同的分析方法之间可以一键切换。
◇ 荧光检测通道&Thermal Cycler Dice Real Time System Lite 光学检测系统配置两个荧光检测通道：FAM/SYBR& Green I，ROX/Texas Red&。如有需要，还可另外增加多两个检测通道(HEX/VIC，Cy5)。
◇ 数据处理&实验图表与数据可以分别保存为多种文件格式，如Excel， Word，PDF 等，也可以选择自动生成实验报告 (以Word或PPT文件格式保存)。报告能自定义显示实验数据或图表，既节省精力，又方便数据管理 。此外，还可根据需要输出RDML数据文件。
TP700实时荧光技术参数：
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TG-11-01 15:33:00
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实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
实时荧光定量PCR原理
所谓实时荧光定量PCR技术
，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR定量PCR扩增荧光曲线图
PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）
2.TaqMan探针法：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；
2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；
3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；
4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；
5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；
6.正式定量实验：对所有样品上机检测；
7.实验结果和数据分析，形成报告。
优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）
（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复）
实时荧光定量PCR技术原理
将标记有的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
实时荧光定量PCRCt 值
Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数
（如图1所示）。
1. 荧光阈值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15
2. Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板的起始的对数存在线性关系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR荧光化学物质
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：和。现将其原理简述如下：
1. TaqMan：PCR扩增时在加入一对的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一，两端分别标记一个报告荧光基团和一个荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2. SYBR：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。
3. ：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光
实时荧光定量PCR传统定量PCR
1．传统定量PCR方法简介
1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和，内标用基因工程方法合成。用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－结合物，最终酶使显色。常规的PCR－ELISA法只是，若加入内标，作出，也可实现定量检测目的。
2．内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过扩增到达平台期时，检测重现性。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3．内标对定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种的方法。
实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在之中，通过对每个Ct值的计算，根据获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用对未知进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR的定量方法
在Real-timePCR中，模板定量有两种策略，相对定量和绝对定量。
实时荧光定量PCR相关应用
实时荧光定量PCR临床疾病诊断
各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。
实时荧光定量PCR动物疾病检测
禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、。
实时荧光定量PCR食品安全
食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业等检测。
实时荧光定量PCR科学研究
医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。
实时荧光定量PCR应用行业
各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
由于qPCR是实时定量检测致病病原体核酸，因此它比、时间分辨、等免疫学方法更具独到优势。
实时荧光定量PCR关于名称
根据MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）
的指导方针，qPCR为Quantitative real-time PCR的简称，RT-qPCR指的是Reverse transcription–qPCR，RT-PCR仅用来表示Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是Real-time PCR
，但是有少数作者并没有坚持这一原则。
．wikipedia[引用日期]
．中国知网[引用日期]
．www.rdml.org[引用日期]
中国电子学会（Chinese Instit...
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1. cDNA产量的很低可能的原因：*RNA模板质量低*对mRNA浓度估计过高*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足*同位素磷32过期*反应体积过大，不应超过50μl2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系*与反应起始时RNA的总量及纯度有关*建议在试验中加入对照RNA*第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：a. 将第一链的反应温度提高至50℃。b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。3. 产生非特异性条带*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。4. 产生弥散（smear）条带*在PCR反应体系中第一链产物的含量过高*减少引物的用量*优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。5. 产生大分子量的弥散条带*大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的*对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果*通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。*有可能是引物二聚体的条带7. 扩增产物滞留在加样孔中*有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。*另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。8. SSⅢ与SSⅡ有何不同？*具有更高的热稳定性（达50℃）*具有更长的半衰期（达220分钟）*对PCR无抑制*干冰运输*Tdt活性更低9. 为什么有人更喜欢用SSⅢ而不是ThermoScript？ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低，SSⅢ则更稳定。10. 为什么使用基因特异性引物（GSP）？GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。11. 什么情况下需要使用RNase H？在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时12. 根据不同的目的选择不同的系统：目的 建议RT与PCR使用不同的引物或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果含Elongase酶的一步法RT-PCR系统二、Generacer1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）*23-28个碱基长度，以提高引物特异性*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低2. 为什么得不到RACE产物？*加入Hela对照*低质量的RNA模板*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。3. RACE的PCR结果有杂带RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。*RNA降解。*PCR管或试剂污染。注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。4. 得不到全长的5’RACE PCR产物*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。二、Generacer1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）*23-28个碱基长度，以提高引物特异性*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低2. 为什么得不到RACE产物？*加入Hela对照*低质量的RNA模板*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。3. RACE的PCR结果有杂带RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。*RNA降解。*PCR管或试剂污染。注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。4. 得不到全长的5’RACE PCR产物*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。三、PCR在进行PCR时：*请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度的引物，也没有加入过量的Mg++*请确保您使用了恰当的退火温度*请确保您没有使用过量的DNA聚合酶四、引物1. 应该选择哪种纯化方法？取决于实验目的和引物的长度2. 为什么我订购了50nmol，但是收到却只有40nmol？50nmol是起始量3. 怎样制备100μM的储液？体积（μl）=质检报告上的nmol数目×104. 怎样设计引物？*一般长度20-30bp；*至少50%的GC含量；*避免引物二聚体和二级结构；*引物对的Tm值应该接近。5. 引物序列有插入或缺失？*使用上游和下游引物多测几个克隆。*请选择正确的纯化方法。6. PCR无结果？*请检查引物设计是否正确；*请检测OD读数是否正确；*做一个阳性对照和一个阴性对照
、操作程序： &&& 1. 将样品等量放置在试管内，并将其对称放入转头； &&& 2. 拧紧转轴螺母，盖好盖门，将仪器接上电源后，实测速度指示灯亮，数码管显示“00000”，表示该仪器已接通电源； &&& 3. 按运转键启动仪器，仪器按出厂所设定的参数工作，数码管显示实际转速和温度；如需制冷，按制冷开关键，温度数码管显示腔内实际温度。 &&& 4.如需调整仪器的运行参数： &&& 1）设定运转时间和运转速度：可按功能键，使相应的指示灯点亮，数码管即显示该参数值，数码管中有一位数字在闪烁，此时可用“ ” 、“ ”及“ ”键相结合调整该参数至需要的值，并按记忆键确认贮存。 &&& 2）设定温度：按制冷功能键，使相应的（上限或下限）指示灯亮，数码管即显示该参数值，数码管中有一位数字在闪烁，此时可用“ ” 、“ ”及“ ”键相结合调整该参数至需要的值，再按一次制冷功能键，退出设定程序。 &&& 5.仪器运行过程中数码管显示转速，当需要查看其他参数时，可按功能键，使该参数的指示灯点亮，数码管即显示该数值。当仪器到达设定的时间或中途停机，停机过程中数码管显示转速，属正常现象。 二、注意事项： &&& 1. 为确保安全和离心效果，仪器必须放置在坚固水平的台面上，工程塑料盖门上不得放置任何物品；样品必须对称放置并在开机前确保已拧紧螺母； &&& 2. 应经常检查转头及实验用离心管是否有裂纹、老化等现象，如有应及时更换； &&& 3. 实验完毕后，需将仪器擦拭干净，以防腐蚀； &&& 4. 如样品比重超过1.2g/cm3，最高转速n=nMax×SQRT（1.2/样品比重）； &&& 5. 机刷长度小于6mm时，必须及时更换； &&& 6.在离心机未停稳的情况下不得打开盖门； &&& 7.仪器必须有可靠接地； &&& 8.该仪器如在电压不稳定地区使用，应增设稳压器，以保证仪器发挥最佳性能。 &&& 9. 插上电源，打开电源开关，仪器控制系统的数码管显示，请按停止键，速度数码管显示OPEN，电子门锁动作，盖门自动微抬，这时可用手打开盖门，如盖门不能自动微抬，3秒钟内必须用手把盖门打开，超过3秒钟电子门锁又自动锁门。若开启盖门，必须按面板上的停止键速度数码管显示OPEN，才能打开盖门。 &&& 10. 如果用户对出厂设定的参数不做任何改动，请将装有等量试液样品的试管对称放入转子孔内，盖好盖门。然后按运转键直接运转。如需改变设定参数，请按面板上的键进行设定并记忆，完毕后按运转键仪器运转。运转结束显示0到OPEN，这时可以打开盖门，如3秒钟内未把门打开，OPEN 变成0，则需按停止键出现OPEN，3秒钟内把门打开。
1、&服务热线:电话010-），提供技术咨询和故障诊断，实时响应； 2、邮件回复& ，对客户提出的问题24小时内进行答复；
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