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普通PCR及测序PCR原理
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DNA测序常见问题及其分析
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&&DNA测序过程可能遇到的问题及分析(欢迎讨论)
DNA测序过程可能遇到的问题及分析(欢迎讨论)
DNA测序过程可能遇到的问题及分析& &&&
& &&&对于一些生物测序公司（ 如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。
为什么呢？
& &&&PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸 ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。
& && &N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。在序列的3’端易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。
& &&&测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。有两种方法可以得到引物序列。1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。由于在测序的起始端总有一些碱基无法准确读出，因此，如果想得到PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。 PCR产物用T载体克隆后，由于克隆的方向是随机的，因此，当在一条链上找不到引物序列时，可以在互补链上寻找引物序列。当测序引物离您的插入片段很近时，有时可能也无法找到引物的全序列。这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或引物二聚体的干扰，造成起始区的序列不好，可能无法找到您的引物完整序列。 对测序引物的一般要求：1).特异性与测序模板结合，不能有多于4个碱基以上的错配现象；2).不能含有混合碱基；3).长度17-25碱基；4).纯度高，最好PAGE纯化；5).用ddH2O溶解，不要用TE/RTE溶解。
质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外援片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时也找不到引物序列。过短的PCR产物纯化困难，一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于200bp，过短的PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此用于测序的PCR产物一般不低于200bp长度。其次，由于测序本身的限制，以一个100bp的PCR产物用于测序为例，去掉两个引物的序列大约40到50bp，再加上测序起始端的一些读不出的碱基，真正能够得到的有用序列不过30～40碱基，这是在最理想的条件下的假设，稍不顺利，测序就失败。因此，过短的PCR产物，只能克隆后进行测序。
& && &此外，ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。
& && &测序自身再就是不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。 大多所谓的PCR"纯化试剂盒"实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致凌乱峰。自己在割胶回收是要注意空离心要充分，不要带入酒精，这样防止造成酒精峰。仪器不要有灰尘，否则会出现钉子峰。还有测序模板要纯，对测序模板DNA的一般要求：1).DNA纯度要求高，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等，否则将有干扰峰；2).溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行，甚至无信号。鉴定时用1.2%琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB(电泳缓冲液中不必加EB)，加一个已知浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等。也可以抽提的质粒DNA的不同构型，质粒DNA的3种构型是在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状(L)分子。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢为开环状(OC)分子。质粒大小可以用商品质粒Marker做标准，或自己的已知质粒做标准。提取质粒的试剂盒或割胶回收试剂盒会提供一个Elution Buffer给用户洗脱DNA，建议用户不要使用，因为其中含有的如EDTA等组分会对测序反应产生干扰，甚至导致测序反应失败，就用ddH2O是最好的。
DNA测序过程可能遇到的问题及分析/结束
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测序结果不好怪测序仪？可能是文库质检方法不对
在高通量测序实验中，为提高测序准确性、减少测序过程中的风险，要求测序前测定文库样品的浓度和片段大小分布，确定合适的上机pooling方案。常规检测包括两方面，文库的浓度检测和片段大小检测。那么问题来了，文库质检技术哪家强？下面小编带大家来看一下这两种检测常用的方法~
1、NanoDrop分光光度计
NanoDrop及其它紫外分光光度计均采用紫外吸光度进行检测。紫外吸收法原理是核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，能吸收紫外光，RNA和DNA的紫外吸收峰在260nm波长处，根据光吸收值计算核酸的含量。
此法操作简便，迅速，但缺点是无法区分出DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质。综合上述的优缺点，最后不建议将该方法用于文库定量的参考，这也是为什么我们文库质检不采用此方法的原因之一。
2、Qubit荧光计
Qubit是新一代核酸和蛋白定量仪，采用荧光染料检测特定目标分子的浓度，能够对DNA和RNA进行精准定量。 荧光染料法采用只有与DNA、RNA或蛋白质结合后才发出荧光的MolecularProbes& 染料，即该荧光染料只有与特异性的靶分子结合时，才能发出荧光信号，但游离核苷酸或降解核酸存在时也可以被检测到。
由于Qubit&技术只检测靶分子的浓度，这种特异性可以获得十分精确的结果，可以作为后续测序定量的参考。
3、实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术（qPCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。
Illumina文库上机测序前会先进行桥式PCR扩增反应，文库测序时的状态其实是扩增后的状态；而以P5和P7（Illumina文库两侧接头）引物做qPCR，其扩增后的产物状态和文库测序时的状态（桥式PCR扩增反应后）是最接近的。因此，以qPCR检测结果做测序上机定量是非常准确的，这也是为什么我们采用此方法来检测文库浓度的原因。
文库浓度检测方法比较
文库片段大小检测
1、琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DN**段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时受电荷效应和分子筛效应的影响，当DNA分子在高于等电点的pH溶液中时会带负电荷，在电场中向正极移动。
琼脂糖凝胶电泳能够获得文库的片段大小范围，但不能确定文库片段大小的精确分布，灵敏度低，且无法检测含量较低的小片段和大片段，检测繁琐费时，效率低下。
2、微流控芯片技术
安捷伦2100和Caliper芯片生物分析仪是基于微流控芯片技术的检测平台，当给芯片加入电压时，样品便在芯片上的显微蚀刻管道中进行毛细管电泳，在样品流动过程中，不同DN**段根据其大小被分离。凝胶-染料基质中的荧光染料可嵌入DNA双链，通过激光激发荧光，使其被仪器检测到，仪器依据收集到的荧光信号强度对样品定量。
微流控芯片技术通过芯片电泳的方式提高平板电泳质量，对文库每一个片段的大小进行精确测定，可对文库进行定性和定量，判断文库构建是否成功。文库测定时可根据需求，选择不同灵敏度芯片。
安捷伦2100芯片检测范围
文库片段大小检测方法比较
上面讲了这么多，大家有没有对文库质检的方法有清晰的了解呢？我们会提供专业的文库质检，真实反映文库的状态，确保文库以最佳的方案测序，下面是文库的送样标准，请大家仔细阅读哦~
HiSeq X 上机文库标准
非HiSeq X 上机文库标准
测序结果不好的锅测序仪不背，其实影响测序结果的因素有很多，包括文库的质量，文库的上机定量，测序仪的状态等，所以文库质检一定不能马虎哦~小编已经把关于文库质检的压箱底知识都分享出来了，希望对大家的测序实验有所帮助，最后欢迎大家多多点赞哦~
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