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miRNA-200c逆转肺癌A549/MTX细胞耐药、转移的作用机制研究最终报告
The mechanism of miRNA-200c reversing metastasis and drug resistance of methotrexate-resistant lung cancer A549 cells final report
公开范围：
报告类型：
报告作者：
[1]李明(安徽省立医院)
中文摘要：
甲氨蝶呤 (methotrexate，MTX) 作为叶酸代谢途径的“基石”，被广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、骨肉瘤、肺癌等恶性肿瘤的治疗。但其在治疗过程中产生的肿瘤细胞耐药以及耐药后肿瘤细胞发生转移均可导致化疗失败，这是MTX治疗肿瘤所面临的一大难题。miRNA-200c在逆转肿瘤耐药和转移中发挥重要作用。本研究以非小细胞肺癌A549/MTX耐药细胞为研究对象， 探讨miR-200c在非小细胞肺癌耐甲氨蝶呤细胞（A549/MTX）对MTX耐药和转移方面的影响及可能的作用机制。
本研究采用实时荧光定量（qRT-PCR）法检测人肺癌亲本细胞株A549细胞、转染miR-200c模拟物（mimic）的A549/MTX细胞（A549/MTX-M）及转染miR-阴性对照（NC）A549/MTX细胞（A549/MTX-N）中miR-200c的表达水平。分别采用MTT法、台酚兰染色及流式细胞术检测A549细胞、A549/MTX-M及A549/MTX-N对MTX的药物敏感性、细胞增殖能力及细胞凋亡变化，并采用qRT-PCR检测其P53和P21的基因表达变化。同时，分别采用细胞划痕实验和transwell实验检测转染后细胞迁移和侵袭能力的改变；再用qRT-PCR检测转染后EZH2和E-钙黏蛋白（E-cadherin, E-cad）基因水平的变化。
研究结果发现miR-200c在A549细胞中的表达水平高于A549/MTX-N细胞(P<0.05)；A549/MTX–M细胞miR-200c水平高于A549/MTX–N细胞(P<0.05)；用不同浓度MTX刺激细胞，与A549/MTX–N细胞比较，A549/MTX-M细胞的增殖能力减弱、凋亡细胞增多，并呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)。另外，转染miR-200c mimic后，与转染miR-NC细胞比较，P53和P21基因表达水平上升(P <0.05)。细胞划痕和transwell实验结果显示， miRNA-200c转染后A549/MTX细胞迁移和侵袭力显著降低，与阴性组相比差异明显。RT-PCR结果显示，miRNA-200c转染后A549/MTX细胞表达EZH2降低，而E-cad水平升高（P <0.05）。
综上所述，本研究发现miR-200c能够逆转A549/MTX 细胞对MTX的耐药性，其作用机制可能是通过P53/P21信号通路诱导细胞凋亡来实现的。miRNA-200c高表达可以降低A549/MTX耐药细胞迁移和侵袭力，其机制可能与抑制EZH2表达上调E-cad水平有关。
英文摘要：
Methotrexate (methotrexate, MTX) is very important in the pathway of folate metabolic , and it was widely used in children with acute lymphoblastic leukemia, malignant lymphoma, osteosarcoma, lung cancer and other malignant tumors treatment. However,the main causes for failure in the treatment with methotrexate are drug resistance and tumor metastasis. miRNA-200c plays an important role in reversion of drug resistance and tumor metastasis.In this study, we explored the effect of miR-200c in reversing resistance and metastasis of non-small cell lung MTX-resistant A549 cells (A549/MTX) and elucidate its related mechanism.
The real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to detect miR-200c expression in A549 cells, transfected with miR-200c mimic A549/MTX cells (A549/MTX-M) and transfected with miR-negative control(NC) A549/MTX cells (A549/MTX-N). MTT assay, trypan blue staining and flow-cytometric analysis were sequentially performed to detect A549, A549/MTX-M and A549/MTX-N cells to MTX drug sensitivity．qRT-PCR was used to detected the gene expressions of P53 and P21 in thses cells．Meanwhile, A549 / MTX cell was transfected with miRNA-200c precursor fragment and the cell invasion and migration were examined by scratch and transwell assay. EZH2 and E-cadherin expression levels were dectected by qRT-PCR in miRNA-200c overexprssed A549/MTX cells
The miR-200c expression in A549 cells was significantly higher than that in A549/MTX-N cells (P<0.05)．The miR-200c expression in A549/MTX-M cells was significantly increased after transfection of miR-200c mimic than that of miR-NC (P<0.05). Compared with A549/MTX-N cells, proliferation inhibition and apoptosis of A549/MTX-M cells significantly increased after treatment with MTX (P<0.05). Furthermore，the up-regulated P53 and P21 were observed in A549/MTX-M cells versus A549/MTX-N cells (P<0.05). Compared with negative group, migration and invasion of A549 / MTX resistant cell was significantly reduced after miRNA-200c transfection. In addition, RT-PCR results showed that the expression of EZH2 was significantly reduced and E-cad was significantly increased in A549 / MTX resistant cell after miRNA-200c transfection（P <0.05）
The study reveals that miR-200c could reduce the resistance of A549/MTX cells to MTX with the possible mechanism of inducing apoptosis through the P53/P21 pathway，and over-expression of miRNA-200c can reduce migration and invasion of A549 / MTX resistant cell through inhibition of EZH2 and upregulation of E-cad levels.
中文关键词：
miRNA-200c; 非小细胞肺癌; 氨甲喋呤; 转移; 耐药
英文关键词：miRNA-200c; non-sm drug resistance
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在人体和动物中，充足的胰岛素分泌能够保证血液中葡萄糖浓度维持在正常的生理范围。在二型糖尿病的发病过程中，胰岛素分泌慢慢减少，直至胰岛B细胞完全死亡然后胰岛素分泌终止。胰腺中的胰岛B细胞缺失是1型和2型糖尿病的标志性事件，然而背后的机制还不清晰。
最近发表在Nature Medicine上的一篇研究发现，小RNA（microRNA-200家族）与胰岛B细胞的存活和糖尿病的形成存在着很大关联。microRNA是一类大约在22个碱基的单链RNA分子，可以通过讲解可以互补配对的信使RNA而抑制蛋白质表达，是一类非常重要的转录后调控分子。越来越多的证据表明，这类RNA在体内扮演着非常重要的作用。而miRNA-200家族在进化上存在着五大保守类群，可能参与了细胞分化、上皮细胞到间叶细胞的转化和转移。
在小鼠中的实验表明，过表达miRNA-200家族的小RNA能明显诱导胰岛B细胞的程序性死亡和致死性的2型糖尿病的形成。在miRNA-200缺失的小鼠中，miRNA-200的表达缺失则会减少胰岛B细胞死亡和抑制2型糖尿病形成，并使得小鼠具有正常的葡萄糖耐性。这就表明了，miRNA-200家族可以调节胰岛B细胞存活，具体是通过负调节抗凋亡和抗压力信号网络的相关蛋白。通过定量PCR和荧光素酶报告系统证明了，在该信号网络中的四种基因的信使RNA是miRNA-200的一个成员miRNA-200c的直接靶标。这些复杂的调控网络会诱导胰岛B细胞的分子伴侣蛋白Dnajc3和激酶抑制蛋白Xiap的表达。他们还发现了miRNA-200的剂量效应可以正调控抑癌基因Trp53的表达，因而形成一种凋亡前的基因表达模式。对Trp53和Bax基因的敲除胰岛细胞，miRNA-200不能正常诱导胰岛B细胞的凋亡和糖尿病的形成。
这个研究将2型糖尿病的形成以及胰岛B细胞的凋亡与miRNA-200联系在了一起，或许通过抑制miRNA-200家族的表达可能成为一种维持胰岛细胞存活和治疗糖尿病的策略。&
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miRNA_200家族在人类肿瘤中的研究进展
关注微信公众号PMCID: PMC3247060The miRNA-200 family and miRNA-9 exhibit differential expression in primary versus corresponding metastatic tissue in breast cancer,1 ,1 ,2 ,3 ,3,4 ,3 and
1,52Department of Pathology, Hospital South, Slagelse, Denmark3Department of Biomarker Discovery, Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark4Bioneer, H&#x000f8;rsholm, Denmark5Department of Oncology, Odense University Hospital, Odense, DenmarkCorresponding author.
ConferenceIX Madrid Breast Cancer ConferenceMadrid, SpainMetastases are the major cause of cancer-related deaths, but the mechanisms of the metastatic process remain poorly understood. In recent years, the involvement of microRNAs (miRNAs) in cancer has become apparent, and the objective of this study was to identify miRNAs associated with breast cancer progression.Global miRNA expression profiling was performed on 47 tumor samples from 14 patients with paired samples from primary breast tumors and corresponding lymph node and distant metastases using LNA-enhanced miRNA microarrays. The identified miRNA expression alterations were validated by real-time PCR, and tissue distribution of the miRNAs was visualized by in situ hybridization.The patients in which the miRNA profile of the primary tumor and corresponding distant metastasis clustered in a unsupervised cluster analysis showed significantly shorter intervals between the diagnosis of the primary tumor and distant metastasis (median 1.6 years) compared with those that did not cluster (median 11.3 years) (P &#x0003c; 0.003). Fifteen miRNAs were identified that were significantly differentially expressed between primary tumors and corresponding distant metastases, including miR-9, miR-219-5p and four of the five members of the miR-200 family involved in epithelial-mesenchymal transition. Tumor expression of miR-9 and miR-200b was confirmed using in situ hybridization, which also verified higher expression of these miRNAs in the distant metastases versus corresponding primary tumors.Our results demonstrate alterations in miRNA expression at different stages of disease progression in breast cancer, and suggest a direct involvement of the miR-200 family and miR-9 in the metastasis process.Articles from Breast Cancer Research : BCR are provided here courtesy of BioMed Central&