2.4.3钙和镁离子含量的测定方法 3 2.4.4硫酸根离子含量的测定方法(EDTA络合滴定法) 4 2.4.5氯离子含量的测定方法 5 2.4.6碳酸根离子的检测方法 6 2.4.7钠离子含量的测定方法 6 2.5化学沉淀法提纯纯碱副产物氯化钠的研究 6 2.5.1化学沉淀法的实验原理 6 2.5.2化学沉淀法的试验方案 7 2.5.3化学沉淀法的实验步骤 7 2.6重结晶法提纯纯碱副产物氯化钠的研究 9 2.6.1重结晶法的实验原理 9 2.6.2重结晶法的试验方案 10 2.6.3重结晶法的实验步骤 10 3．结果与讨论 1 3.1原样品中各组分测定结果与讨论 1 3.2化学沉淀法的实验结果与讨论 1 3.2.1化学沉淀法单因素实验结果与讨论 1 3.2.2化学沉淀法正交实验结果与讨论 5 3.2.3化学沉淀法产品中各组分含量测定的结果与讨论 10 3.3重结晶法的实验结果与讨论 10 3.3.1重结晶法单因素实验结果与讨论 10 3.3.2重结晶法正交实验结果与讨论 12 3.3.3在不同的操作条件下氯化钠晶体的显微镜图 17 3.3.4重结晶法产品中各组分含量测定的结果与讨论 18 3.4试验误差分析 18 3.4.1化学沉淀法误差分析 18 3.4.2重结晶法误差分析 吨的纯碱就要排放蒸氨废液大约10m3，其中含有大量的NaCl和CaCl2，如果将其直接排放，不仅会造成环境的污染，而且还浪费资源。目前，部分企业利用蒸氨废液生产工业级氯化钠，取得了一定的经济效益，但是，这些副产物中氯化钠的纯度相对较低，只有少部分的下游企业用得上，不能满足大众化工企业的需求。这样将会降低纯碱副产物氯化钠的市场竞争力，从而制约纯碱副产物氯化钠的发展。为了满足大多数化工企业的需求，将纯碱副产物氯化钠进行进一步的提纯，使其的纯度达到工业用盐的要求或者是纯度更高的食品用盐是解决问题的有效方法。 化学沉淀法和重结晶法都是提纯氯化钠的重要方法，但是化学沉淀法和重结晶法除去杂质的工艺尚不清楚，所以本课题欲解决的主要问题是通过实验来确定化学沉淀法和重结晶法提纯纯碱副产物氯化钠的最佳工艺条件。 1.2 本课题研究的目的和意义 1.2.1 目的 1.2.2 意义 1.3 纯碱副产物氯化钠提纯研究现状 1.3.1 氯化钠提纯的方法 1.3.1.1 洗涤法[1] 是工艺、技术成熟、设备投资省、产品质量稳定1.3.1.2 化学沉淀法[2] 沉淀法是在溶液状态下,再将沉淀物1.3.1.3 重结晶法[4] 固体混合物在溶剂中的溶解度与温度有密切关系。一般是温度升高，溶解度增大。若把固体溶解在热的溶剂中达到饱和，冷却时即由于溶解度降低，溶液变成过饱和而析出晶体。利用溶剂对被提纯物质及杂质的溶解度不同，可以使被提纯物质从中析出。而让杂质全部或大部分仍留在溶液中，从而达到提纯目的。 1.3.2 氯化钠的生产现状 1.3.2.1 国外氯化钠的生产现状[5] 1.3.2.2 国内氯化钠的生产现状[5] 2.材料和方法 2.1 实验材料 2.2 实验试剂及仪器 2.2.1 实验试剂 名称 规格 生产厂家 乙二胺四乙酸二钠 AR 天津永晟精细化工有限公司（原盛淼精细化工公司） 氯化铵 AR 烟台市双双化工有限公司 浓氨水 AR 烟台市双双化工有限公司

1.本发明涉及蛋白纯化的方法，特别是使用离子交换层析。提供了适用于通过离子交换层析纯化的修饰的蛋白和肽标签，以及相关方法。

2.重组蛋白的生产需要通过从生产它们的细胞中分离它们来纯化蛋白，这通常是生产过程中最耗时和昂贵的因素。对于用于医学和治疗应用的蛋白尤其如此，因为需要非常高水平的纯度。蛋白纯化通常依赖于多步骤过程中几种技术的组合，从细胞碎片的细胞分解去除开始，接着从其他细胞蛋白和杂质中分离所需蛋白。所需的材料量和浓度、所需的天然折叠/活性、纯度、多聚体蛋白的亚基含量、翻译后修饰指导蛋白策略设计。为了设计合适的蛋白纯化方法，关键是评估蛋白溶解度，其在高或低浓度下的不稳定性及其对盐浓度、温度、ph和氧化的敏感性。此外，当旨在组合不同的纯化步骤时，希望减少或甚至废除透析和浓缩的任何中间步骤。
3.纯化通常涉及在纯化早期使用的批量或分批方法，其适用于大体积且有效地去除非蛋白物质(核酸、多糖和脂质)，随后是适用于获得高纯度产物的更精制的方法。批量方法包括盐析、用有机聚合物进行的相分配、用有机溶剂进行的沉淀(可导致变性)、在非常低的盐浓度下的等电沉淀、热沉淀和聚乙二醇(非离子聚合物)沉淀。注意剧烈的方法(例如加热、极端ph或用有机溶剂进行的相分配)仅适用于稳定的蛋白。沉淀是一种快速、温和、可放大和相对便宜的方法，由于对靶标的分馏和浓缩，而广泛用于实现对靶标蛋白的充分富集。硫酸铵(as)和聚乙烯亚胺(pei)是最广泛使用的沉淀剂。as对蛋白结构稳定，非常可溶，相对便宜，并且允许利用盐溶入-盐溶出现象的蛋白分馏。相似地，pei在中性ph下是带正电荷的分子，并且其与带负电荷的大分子(例如核酸和酸性蛋白)结合，形成迅速沉淀的网络。
4.用于纯化的精制程序通常从高容量程序进行到低容量程序，并且除其他外，包括离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水相互作用层析、羟基磷灰石上的蛋白层析和固定化金属亲和层析。固定化金属亲和层析(imac)是基于通过强螯合剂固定在固体基质上的过渡金属离子(例如zn2+、cu2+、ni2+和co2+)与水溶液中的组氨酸和半胱氨酸的亲和力的技术。该技术通常用于结合ni2+柱的重组his-标签蛋白(用包含6个或更多个组氨酸残基的表位表达的蛋白)。imac的主要优点是它的低成本、稳健性和使用的简单性，因为它也可在变性、氧化和还原条件下工作，具有相对高的亲和力和特异性。主要的限制包括需要避免螯合剂(edta以及潜在的螯合基团，例如tris)，his标签序列的潜在免疫原性，镍从imac基质中浸出的变应原作用和污染蛋白(例如具有天然金属结合基序的蛋白、在其表面具有组氨酸簇的蛋白、例如通过陪伴分子机制与异源表达的his-标签蛋白结合的蛋白、以及对琼脂糖基支持物具有亲和力的蛋白)的共纯化。另外，imac不适用于对金属离子敏感的蛋白和易受氧化或蛋白水解损伤的蛋白，因为imac固定相对螯合剂或还原剂不耐受。
5.离子交换层析是分离蛋白的通用方法，经常用于分析和制备目的。离子交换层析可以实现高分辨率，同时纯化和浓缩目标物。
6.离子交换剂由以下组成：基础基质，通常是提供宽吸附表面的多孔珠，其上固定有带电配体，通常是带电聚合物以提高所述树脂的容量。交换剂本身是酸和碱，且它们在宽或窄ph范围上的质子化程度取决于它们是强酸强碱还是弱酸弱碱。
7.蛋白、多核苷酸和其他生物大分子可与离子交换剂相互作用，因为它们暴露其表面上的带电部分，该现象取决于溶液的ph和它们的等电点(pi)，其可基于蛋白序列估计，只要不存在翻译后修饰。阳离子交换剂带负电荷，并在其pi以下结合带正电荷的蛋白。阴离子交换剂是带正电荷的，并在其pi以上结合带负电荷的蛋白。蛋白与离子交换树脂的结合不仅取决于蛋白的总电荷，而且还取决于诸如蛋白表面上的电荷分布的因素，所述电荷分布影响蛋白与树脂的结合，所述结合以定向方式发生。因此，蛋白与离子交换剂结合的预测不能基于蛋白的一级结构，并且并非总是可能实现所需蛋白与离子交换树脂的良好结合，特别是在为了保持适当的折叠和功能所需的生理ph下。离子交换层析可用于分离完整和截短形式的蛋白或蛋白变体和/或同种型，其特征在于相同的一级结构但不同的表面结构，从而反映在离子交换剂上的不同保留；例如，分离单个电荷不同的蛋白变体是可能的。这可以非常快速地完成，因为离子交换层析可以在室温和高达500cm/h的线性流速下操作，在少于5分钟内实现蛋白分离。然而，并不是所有蛋白都适用于使用离子交换层析的简单分离，因为取决于它们的电荷特性，它们可能不与某些离子交换树脂结合，或者可能不足够强地结合，从而不能以高产率实现有效的分离。

8.本发明提供了一种融合蛋白，其包含目标蛋白和肽标签。优选地，所述肽标签能够与离子交换树脂、特别是阳离子交换树脂结合。所述肽标签用于增强所述蛋白与离子交换树脂的结合并促进通过离子交换层析纯化的蛋白的纯化。用于金属离子柱上的亲和层析(例如imac)的肽标签(例如his-标签)是本领域已知的。然而，本发明人已发现肽标签也可用于允许或优化通过离子交换层析进行的蛋白纯化。有效实现该目的的标签已被开发并在本文中公开。
9.因此，本发明提供了一种适于通过离子交换层析纯化的融合蛋白，所述蛋白包含(i)目标蛋白，和(ii)在n或c末端的肽标签。所述标签适当地包含(hr)n、(pr)n、(sr)n或(psr)n或由(hr)n、(pr)n、(sr)n或(psr)n组成，其中
n’是优选地2至6的整数，包括端值。
n’是优选地2至6的整数，包括端值。
11.还提供了一种融合蛋白，其包含与能够结合离子交换树脂的肽标签直接或间接共价连接的目标蛋白。所述标签适当地包含(hr)n、(pr)n、(sr)n或(psr)n或由(hr)n、(pr)n、(sr)n或(psr)n组成，其中
n’是优选地2至6的整数，包括端值。
12.所述肽标签的长度适当地是4至20个氨基酸，优选地4至12个氨基酸。优选地，所述标签包含带电荷的氨基酸。所述标签也可以包含一个或多个脯氨酸残基。在一个实施方式中，所述标签包含seq id no 4-6、8或9中任一个的氨基酸序列或由seq id no 4-6、8或9中任一个的氨基酸序列组成。
13.在一个实施方式中，所述标签不是his标签，即不包含hn，其中
方式中，所述标签不是his6标签。在疫苗抗原的情况下，使用不是his标签的标签降低了诱导或作为与his-标签蛋白交叉反应的抗体的靶标的风险，所述his-标签蛋白通常通过亲和层析产生和纯化。
14.所述融合蛋白可以进一步在所述目标蛋白和所述肽标签之间包含接头。所述接头可以有利地包含具有中至高自由度的氨基酸，提供柔性接头，例如g或s。在一个实施方式中，所述接头包含gg、gs、ss、sg或ggsgg。
15.所述目标蛋白可以是抗原蛋白，例如疫苗抗原，和/或用于与多糖偶联的载体蛋白。典型的载体蛋白包括破伤风类毒素(tt)、白喉类毒素(dt)、crm
pneumoniae)的解毒的肺炎球菌溶血素、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(ompc)。细菌疫苗抗原，例如来自金黄色葡萄球菌(s.aureus)的解毒的hla或来自金黄色葡萄球菌的clfa也可用作载体蛋白。
16.在一个实施方式中，所述目标蛋白是来自铜绿假单胞菌的外毒素a(epa)。所述epa可以包含seq id no.10的氨基酸序列或与seq id no.10至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。所述epa蛋白可以被修饰使得其包含在对应于seq id no.10的位置l552的氨基酸位置处的l至v置换，和/或seq id no.19至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处的氨基酸置换，所述置换是任选地h35l。所述hla蛋白可以被修饰使得一个或多个氨基酸已被选自以下的一个或多个共有序列置换：d/e-x-n-z-s/t(seq id no.25)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id 85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处的氨基酸置换。在一个实施方式中，所述置换分别是h至c和g至c。
18.在一个实施方式中，所述融合蛋白包含(i)本文公开的epa蛋白，和(ii)由seq id no:4-6、8或9中任一个组成或包含seq id no:4-6、8或9中任一个的肽标签。在一个优选的实施方式中，所述肽标签包含seq id no:6、8和9中任一个或由seq id no:6、8和9中任一个组成。在一个优选的实施方式中，所述肽标签包含seq id no:8或由seq id 19.在一个实施方式中，所述融合蛋白包含(i)本文公开的h1a蛋白，和(ii)由seq id no:4-6、8或9中任一个组成或包含seq id no:4-6、8或9中任一个的肽标签。在一个优选的实施方式中，所述肽标签包含seq id no:4或由seq id no:4组成。
20.在一个实施方式中，所述融合蛋白包含seq id no:12-14、17、18、41、42、44、46或47中任一个的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述融合蛋白包含seq id no:14、17、18、44、46或47中任一个的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述融合蛋白包含seq id no:21的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述融合蛋白不包含seq id no:24的氨基酸序列。
21.在一个方面，本发明提供了一种纯化本发明的融合蛋白或本发明的缀合物或本发明的生物缀合物的方法，所述方法包括离子交换层析的步骤。在一个实施方式中，离子交换层析的步骤将涉及以下步骤：
22.(i)使用上样缓冲液使所述融合蛋白与离子交换树脂结合，
23.(ii)使用洗涤缓冲液洗涤所述离子交换树脂，和
24.(iii)使用洗脱缓冲液从所述离子交换树脂洗脱所述蛋白。
25.一方面，本发明提供了一种纯化目标蛋白的方法，所述方法包括(i)产生包含所述目标蛋白和与离子交换树脂结合的肽标签的融合蛋白，和(ii)通过离子交换层析纯化所述融合蛋白。本文公开了合适的肽标签。
26.在一个方面，本发明提供了一种纯化目标蛋白的方法，其包括使所述蛋白经受离子交换层析，其中已经通过在n或c末端添加本文公开的肽标签修饰了所述蛋白。本文公开了合适的肽标签。
27.在一个方面，本发明提供了一种缀合物(例如生物缀合物)，其包含与本文所公开的目标蛋白连接(例如共价连接)的多糖(例如多糖抗原)。
28.本发明还提供了一种缀合物(例如生物缀合物)，其包含与本发明的融合蛋白连接(例如共价连接)的多糖(例如多糖抗原)。
29.一方面，本发明提供了一种编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。
30.一方面，本发明提供了一种包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸的载体。
31.一方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含本发明的融合蛋白、或本发明的缀合物、或本发明的生物缀合物和药学上可接受的赋形剂或载体。
32.一方面，本发明提供了一种疫苗，其包含本发明的融合蛋白、或本发明的缀合物、或本发明的生物缀合物和药学上可接受的赋形剂或载体。
33.一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白和药学上可接受的赋形剂或载体。
34.一方面，本发明提供了一种制备本发明的免疫原性组合物的方法，其包括将本发明所述的融合蛋白或缀合物或生物缀合物与药学上可接受的赋形剂或载体混合的步骤。
35.一方面，本发明提供了一种免疫人宿主的方法，其包括向所述宿主施用本发明的融合蛋白、或本发明的缀合物、或本发明的生物缀合物。
36.在一个方面，本发明提供了一种在受试者中诱导对抗原(例如本文所述的目标蛋白)的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的本发明的融合蛋白、或本发明的缀合物、或本发明的生物缀合物。
37.一方面，本发明提供了一种本发明的融合蛋白、或本发明的缀合物，或本发明的生物缀合物以用于医学治疗或预防的方法中。
39.图2：在阳离子交换柱上纯化携带c-末端hrhr标签的cp5-h1a(用抗-h1a抗体的western印迹)。凝胶a：上样40微升。凝胶b：上样20微升。
40.图3：在阳离子交换柱上纯化不加标签的cp5-h1a。使用不加标签的cp5-h1a进行与图2相同的步骤。凝胶a：上样20微升。凝胶b：上样40微升。
51.肽标签：如本文所用，术语“肽标签”是指与目标蛋白的n-或c-末端融合的短的(优选地2-20个氨基酸、更优选地4至20个氨基酸)氨基酸序列。
52.标签蛋白：如本文所用，“加标签的蛋白”是指包含具有与n或c末端融合的肽标签的目标蛋白的多肽。所述加标签的蛋白还可以在所述蛋白和所述肽标签之间包含氨基酸接头，其优选地是一个或两个氨基酸。
53.融合蛋白：如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含来自不同多肽的氨基酸序列的蛋白。方便地，其可以由编码两个或更多个氨基酸序列的单个核苷酸序列(例如包含2个或更多个基因的单个核苷酸序列)或基因、部分基因或编码肽或多肽的其他核苷酸序列编码。
54.如本文所用，术语“载体蛋白”是指与多糖抗原(例如糖抗原)共价连接以产生缀合物(例如生物缀合物)的蛋白。载体蛋白激活与其缀合的多糖抗原相关的t细胞介导的免疫。
55.如本文所用，术语“生物缀合物”是指在宿主细胞背景中制备的蛋白(例如载体蛋白)和抗原(例如糖)之间的缀合物，其中宿主细胞机制使所述抗原与所述蛋白连接(例如n-连接)。
57.除脯氨酸(pro，p)之外的任何氨基酸：是指选自丙氨酸(ala，a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、缬氨酸(val，v)的氨基酸。
58.epa：铜绿假单胞菌的外毒素a。
59.hla：溶血素a，也称为α毒素，来自葡萄球菌细菌，特别是金黄色葡萄球菌。
60.cp：荚膜多糖。
61.如本文所用，术语“有效量”在向受试者施用疗法(例如本发明的免疫原性组合物或疫苗)的背景中是指具有预防和/或治疗效果的疗法的量。
62.如本文所用，术语“受试者”是指动物，特别是哺乳动物，例如灵长类动物(例如人)。
63.如本文所用，提及两个氨基酸或核酸序列之间的百分比序列同一性是指当比对时，在两个序列的比较中，氨基酸或碱基的百分比相同。这种比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序(例如在current protocols in molecular id)的百分比同一性理想地基于该序列的全长计算。不同长度的两个序列之间的百分比序列同一性是优选地基于较长序列的长度计算的。可以使用全局或局部比对。优选地，使用全局比对。
64.如本文所用，术语融合蛋白或目标蛋白或其缀合物(例如生物缀合物)的“纯化(purifying/purification)”是指将其从一种或多种污染物中分离。污染物是不同于所述融合蛋白或目标蛋白或其缀合物(例如生物缀合物)的任何物质。污染物可以是例如细胞碎片、核酸、脂质、除融合蛋白或目标蛋白之外的蛋白、多糖和其他细胞组分。
[0065]“重组”多肽是在用编码所述多肽的核酸转化或转染的宿主细胞中产生的多肽，或由于同源重组而产生的多肽。
如本文所用，术语“保守氨基酸置换”涉及非天然残基对天然氨基酸残基的置换，使得对该位置处的氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性影响很小或没有影响，并且不会导致免疫原性降低。例如，这些可以是以下基团内的置换：缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。对多肽序列的保守氨基酸修饰(以及对编码核苷酸的相应修饰)可产生具有与亲本多肽的功能和化学特征相似的功能和化学特征的多肽。
如本文所用，术语“缺失”是从蛋白序列中去除一个或多个氨基酸残基。通常，在蛋白分子内的任何一个位点处缺失不超过约1至6个残基(例如1至4个残基)。
如本文所用，术语“插入”是在蛋白序列中添加一个或多个非天然氨基酸残基。通常，在蛋白分子内的任何一个位点处插入不超过约1至6个残基(例如1至4个残基)。
如本文所用，术语“包含”表示除所列的那些之外还可存在其他组分，而术语“由
组成”表示其他组分不存在或不以可检测的量存在。术语“包含”自然地包括术语“由
本发明使用的肽标签与离子交换树脂、特别是阳离子交换树脂结合。所述标签因此适当地包括带电荷的氨基酸残基，例如k、r、h、d和e。当所述标签用于与阳离子交换树脂结合时，优选k、r、h，特别是h和r。也可包括例如脯氨酸的残基以改善所述标签中带电荷的残基的可及性。
本领域技术人员将理解，根据所述目标蛋白的大小、氨基酸组成、电荷和电荷可及性，可以调整所述标签的氨基酸组成和长度以优化与离子交换树脂的结合。例如，所述标签越长，其与所述树脂的结合越强，因此在给定ph下仅具有低总电荷的蛋白可能需要更长的标签。
在一个实施方式中，肽标签的长度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸。优选地，所述标签的长度在4和12个氨基酸之间。
n’是2、3、4、5或6的(pr)n是特别合适的标签。
在一个实施方式中，所述标签是hrhr。在一个实施方式中，所述标签包含hrhr。在一个特定的实施方式中，所述标签蛋白是h1a，并且所述标签是hrhr。在一个特定的实施方式中，所述标签蛋白包含seq id no 24的氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述标签不是his-标签。在一个实施方式中，所述标签不是
e553，和糖位点kdqnatk对一个或多个氨基酸的置换。
no:4-6、8或9中任一个的氨基酸序列组成的肽标签。在一个实施方式中，所述融合蛋白可以包含以下或由以下组成：seq id no:10或seq id no:11的氨基酸序列，或者与seq id no:10或seq id no:11至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及包含seq id no:6、8或9中任一个的氨基酸序列或由seq id no:6、8或9中任一个的氨基酸序列组成的肽标签。在一个优选的实施方式中，所述融合蛋白可以包含以下或由以下组成：seq id no:10或seq id no:11的氨基酸序列，或者与seq id no:10或seq id no:11至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及包含seq id no:8或seq id no:9中任一个的氨基酸序列或由seq id no:8或seq id no:9中任一个的氨基酸序列组成的肽标签。在一个特别优选的实施方式中，所述融合蛋白可以包含以下或有以下组成：seq id no:10或seq id no:11的氨基酸序列，或者与seq id no:10或seq id no:11至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及包含seq id no 8的氨基酸序列或由seq id no 8的氨基酸序列组成的肽标签。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含以下或由以下组成：seq id no:12-14、17、18、41、42、44、46或47中任一个的氨基酸序列，其任选地具有本文所述的一个或多个糖位点的插入。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含以下或有以下组成：seq id no:14、17、18、44、46或47中任一个的氨基酸序列，其任选地具有本文所述的一个或多个糖位点的插入。在一个优选的实施方式中，所述融合蛋白包含以下或由以下组成：seq id no:17、seq id no:18、seq id no:46或seq id no:47的序列，其任选地具有本文所述的一个或多个糖位点的插入。在一个特别优选的实施方式中，所述融合蛋白包含seq id no:17或seq id no:46的序列，其任选地具有本文所述的一个或多个糖位点的插入。
在一个特定的实施方式中，所述目标蛋白是h1a。
在一个实施方式中，所述目标蛋白可以是包含以下或由以下组成的hla序列：seq id no.19的氨基酸序列或与seq id no.19至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述目标蛋白包含以下或由以下组成：与seq id no.19至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其被修饰使得所述氨基酸序列包含在seq id no.19的h48和g122位置处或在与seq id no.19至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列(例如seq id no:20)内的等同位置处的氨基酸置换，其中所述置换分别是h至c和g至c。
所述修饰的h1a蛋白可被进一步修饰使得所述氨基酸序列包含在seq id no.19的位置h35(例如h35l)处或在与seq id no.19至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列(例如seq id no:4-6、8或9中任一个的氨基酸序列组成的肽标签。在一个实施方式中，所述融合蛋白可以包含以下或由以下组成：seq id no:24的氨基酸序列组成。
所述目标蛋白可以在n-末端进一步包含信号序列，例如能够将所述h1a蛋白导向宿主细胞(例如细菌)的周质的信号序列。这在所述目标蛋白是用于生物缀合物的载体蛋白时是特别有用的。在特定实施方式中，所述信号序列可以来自大肠杆菌(e.coli)鞭毛蛋白(flgl)[mikflsalilllvttaaqa(seq id no:35)。当所述目标蛋白是h1a、特别是本文所述的h1a蛋白时，所述信号序列可以是flg1(seq id no:29)。
在一些实施方式中，所述目标蛋白与多糖缀合以形成缀合物。在疫苗的背景中，抗原多糖与蛋白载体的缀合是保护性记忆应答所必需的，因为多糖是不依赖于t细胞的抗原。可以通过不同的化学方法，使用所述多糖以及所述蛋白载体中的激活反应性基团，和通过利用将细菌多糖与蛋白偶联的酶的生物缀合方法，使多糖与蛋白载体缀合。
在一个实施方式中，所述缀合物包含这样的缀合物，其包含以下(或由以下组成)：与多糖抗原共价连接的本文公开的目标蛋白，其中所述抗原与所述蛋白的氨基酸残基连接(直接或通过接头)。
在一个实施方式中，所述缀合物包含这样的缀合物，其包含以下(或由以下组成)：与多糖抗原共价连接的本发明的融合蛋白，其中所述抗原与所述融合蛋白的氨基酸残基连
接(直接或通过接头)。
在一个实施方式中，所述缀合物是生物缀合物。在一个实施方式中，所述缀合物是化学缀合物。在一个实施方式中，本发明的缀合物(例如生物缀合物)中的抗原是糖，例如细菌荚膜糖、细菌脂多糖或细菌寡糖。在一个实施方式中，所述抗原是细菌荚膜糖。
细菌荚膜糖可以是例如：脑膜炎奈瑟菌(n.meningitidis)血清组a荚膜糖(mena)、脑膜炎奈瑟菌血清组c荚膜糖(menc)、脑膜炎奈瑟菌血清组y荚膜糖(meny)、脑膜炎奈瑟菌血清群w荚膜糖(menw)、乙型流感嗜血杆菌(h.influenzae)荚膜糖(hib)、b组链球菌属i组荚膜糖、b组链球菌属ii组荚膜糖、b组链球菌属iii组荚膜糖、b组链球菌属iv组荚膜糖、b组链球菌属v组荚膜糖，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)5型荚膜糖、金黄色葡萄球菌8型荚膜糖、来自伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)的vi糖、脑膜炎奈瑟菌lps(例如l3和/或l2)、卡他莫拉菌(m.cararrhalis)lps、流感嗜血杆菌lps、志贺氏菌属o-抗原、铜绿假单胞菌o-抗原、大肠杆菌o-抗原或肺炎链球菌荚膜多糖。
在一个实施方式中，所述目标蛋白通过生物缀合方法与所述多糖连接。简而言之，所述方法涉及细菌细胞(例如诸如大肠杆菌细胞的革兰氏阴性细胞)中糖蛋白的体内生产。所述多糖通过具有特定特异性的不同糖基转移酶组装在来自细胞质膜处常见前体(激活的糖核苷酸)的载体脂质上。多糖的合成始于将单糖加至所述膜的细胞质侧的载体脂质十一异戊二烯基磷酸酯中。通过不同的糖基转移酶顺序添加来自激活的糖核苷酸的单糖来构建所述抗原，并且脂质连接的多糖通过翻转酶翻转穿过所述膜。抗原重复单元通过酶反应聚合。然后通过连接酶将所述多糖转移至所述脂质并输出至周质。在周质处，可以使用细菌寡糖基转移酶(例如来自空肠弯曲菌的pgib)使所述多糖与蛋白载体连接(例如n-连接)。
n-连接的蛋白糖基化—碳水化合物分子添加至目标蛋白的多肽链中的天冬酰胺残基—通常发生在真核生物中。在真核生物中，该过程由酶促寡糖基转移酶复合物(ost)完成，所述复合物负责将预组装的寡糖从脂质载体(磷酸多酚)转移至内质网中保守序列asn-x-ser/thr(其中x是除脯氨酸之外的任何氨基酸)内新生蛋白的天冬酰胺残基。食物携带的病原体空肠弯曲菌也可以使用由称为“pgl”的簇(用于蛋白糖基化)编码的糖基化机制的n-糖基化蛋白(wacker等，science.2002；298(-3)。空肠弯曲菌糖基化机制可转移至大肠杆菌以允许大肠杆菌细胞表达的重估蛋白的糖基化。以前的研究已经证明如何产生可以进行n-糖基化的大肠杆菌菌株(参见例如wacker等，science.2002；298(-3；nita-lazar等，glycobiology.2005；15(4):361-7；feldman等，proc 和wo/和wo)。生物缀合物的产生还详细描述于例如国际专利申请号pct/ep(公开为wo 14/037585)和国际专利申请号pct/ep中。
因此，用于产生生物缀合物的宿主细胞被工程化以包含异源核酸，例如编码一种或多种载体蛋白的异源核酸和/或编码一种或多种蛋白的异源核酸，例如编码一种或多种蛋白的基因。可以将编码参与糖基化途径(例如原核和/或真核糖基化途径)的蛋白的异源核酸引入本发明所述的宿主细胞中。这样的核酸可以编码包括寡糖基转移酶、差向异构酶、翻转酶、聚合酶和/或糖基转移酶的蛋白。
因此，本发明提供了一种宿主细胞，其包含：
i)一种或多种编码糖基转移酶的核酸；
ii)编码寡糖基转移酶的核酸；
iii)编码本发明的融合蛋白的核酸；和任选地
iv)编码聚合酶(例如wzy)的核酸。
还提供了用于产生包含与糖连接的本发明的融合蛋白(或由与糖连接的本发明的融合蛋白组成)的生物缀合物的方法，所述方法包括：(i)在适于蛋白产生的条件下培养本发明的宿主细胞，和(ii)分离由所述宿主细胞产生的生物缀合物。
在另一个实施方式中，所述目标蛋白通过使用化学缀合方法可获得的化学键与所述多糖共价连接(即所述缀合物通过化学缀合产生)。
在一个实施方式中，所述化学缀合方法选自碳二亚胺化学、还原胺化、氰基化化学(例如cdap化学)、马来酰亚胺化学、酰肼化学、酯化学和n-羟基琥珀酰亚胺化学。缀合物可通过us(hausdorff)、us 4365170(jennings)和us 95/08348和wo 96/29094中。另参见chu c.等infect.immunity，。
离子交换层析技术和原理在本领域中是公知的，并且详细描述于诸如例如weiss，
离子交换树脂由基础基质构成，通常是提供宽吸附表面的多孔珠，其上固定有带电配体，通常是带电聚合物以提高树脂的容量，并固定化。交换树脂本身是酸和碱，且它们在宽或窄ph范围上的质子化程度取决于它们是强酸强碱还是弱酸弱碱。
离子交换层析需要特征在于机械稳定性、降低的非特异性吸附、更高的结合能力和加速的传质的固定相。固定相通常由包含液体填充孔的珠状基质构成。机械稳定的功能性基质通常是多糖(纤维素、葡聚糖和琼脂糖)，合成有机聚合物(聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯)和无机材料(二氧化硅、羟基磷灰石)，它们是化学交联的并且用功能性配体修饰。它们的粒径范围是2μm(为分析目的)至最高约200μm(为低压制备应用)，而孔径在10-100nm的范围内。
由于蛋白与交换树脂的结合发生在低盐浓度下，且洗脱发生在高盐浓度下，离子交换层析柱应当用含盐缓冲液(适当地为1m nacl)洗涤以使带电荷的配体完全饱和，然后用适于维持蛋白溶解度和稳定性的缓冲液平衡。在尽可能类似于包含低盐浓度的平衡缓冲液的ph和电导率下进行蛋白上样以允许蛋白与交换剂结合。上样后，通常用平衡缓冲液(可能包含特定补充物)洗去未结合的物质。洗脱可以通过等度或梯度洗脱进行；梯度洗脱是优选的，因为它拓宽了洗脱窗口并且可以由线性或阶跃盐梯度组成，通常由两种缓冲液(平衡缓冲液和用于反离子装载的缓冲液)的梯度组成。替代地，可通过ph梯度进行洗脱。
通常，然后，离子交换层析的步骤将涉及以下步骤：
(i)使用上样缓冲液使所述融合蛋白与离子交换树脂结合，
(ii)使用洗涤缓冲液洗涤所述离子交换树脂，和
(iii)使用洗脱缓冲液从所述离子交换树脂洗脱所述蛋白。
所述离子交换树脂可以是阳离子交换剂或阴离子交换剂。宽范围的预制备的树脂是可商购的，具有不同的强度和粒径。可商购的阳离子交换(
平衡缓冲液、上样缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的组成可由本领域技术人员根据本领域的常规程序来选择。合适的缓冲液是本领域公知的，如例如上文所述的weiss，
ion exchange chromatography principles and methods’中所述的。层析缓冲液的选择取决于目标蛋白pi，取决于其稳定性和溶解度，还取决于所述交换剂的特性；应当避免可与交换剂结合的缓冲液(例如tris和乙酸盐)。优选地，推荐10-100mm缓冲液浓度，其对应于1-4ms/cm的电导率。
在一个实施方式中，相同的缓冲液可用于上样和洗涤，然后在所述洗脱缓冲液中增加盐浓度。例如，20mm柠檬酸盐、50mm nacl(ph 5.5)可用于上样和洗涤，然后使用20mm柠檬酸钠、50-500mm nacl(ph5.5)进行洗脱。
可以重复所述离子交换层析的步骤，任选地使用不同的离子交换树脂。
可以在所述离子交换层析的步骤之前或之后进行另外的纯化步骤，例如脱盐或透析。
本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请在此通过引用并入本文。
本发明的各方面概括在以下编号的段落中：
1.一种适于通过离子交换层析纯化的融合蛋白，所述蛋白包含：
(ii)在n或c末端的肽标签；
n’是2至6的整数，包括端值。
2.一种融合蛋白，其包含与能够结合离子交换树脂的肽标签直接或间接共价连接的目标蛋白，其中所述肽标签包含(hr)n、(pr)n、(sr)n或(psr)n，其中
n’是2至6的整数，包括端值。
3.根据段落1或段落2所述的融合蛋白，其中所述肽标签的长度是4至20个氨基酸。
4.根据段落3所述的融合蛋白，其中所述肽标签的长度是4至12个氨基酸。
5.根据段落1至4中任一项所述的融合蛋白，其中所述肽标签包含seq id no 4-6、8和9中任一个的氨基酸序列。
6.根据段落5所述的融合蛋白，其中所述肽标签由seq id no 4-6、8和9中任一个的氨基酸序列组成。
7.根据段落1至6中任一项所述的融合蛋白，其进一步在所述目标蛋白和所述肽标签之间包含接头。
8.根据段落7所述的融合蛋白，其中所述接头包含gg、gs、ss、sg或ggsgg。
9.根据段落1至8中任一项所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白是抗原蛋白或载体蛋白。
10.根据段落9所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白是破伤风类毒素(tt)、白喉类毒素(dt)、crm
、来自空肠弯曲菌的acra、来自流感嗜血杆菌的蛋白d、铜绿假单胞菌的外毒素a(epa)、来自肺炎链球菌的解毒的肺炎球菌溶血素、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(ompc)、来自金黄色葡萄球菌的解毒的hla或来自金黄色葡萄球菌的clfa。
11.根据段落10所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白是来自铜绿假单胞菌的外毒素a(epa)。
12.根据段落11所述的融合蛋白，其中所述epa包含seq id no.10的氨基酸序列或与seq id no.10至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
13.根据段落11或段落12所述的融合蛋白，其中所述epa蛋白被修饰使得
14.根据段落11至13中任一项所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白包含seq id no:11的氨基酸序列或与seq id no.11至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
15.根据段落1至14中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含(i)段落11至14中任一项定义的epa，和(ii)段落1至6中任一项定义的肽标签。
16.根据段落15所述的融合蛋白，其中所述肽标签包含seq id no:6、8或9中任一个的氨基酸序列或由seq id no:6、8或9中任一个的氨基酸序列组成。
17.根据段落16所述的融合蛋白，其中所述肽标签包含seq id no:8的氨基酸序列或由seq id no:8的氨基酸序列组成。
18.根据段落15所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no:12-14、17、18、41、42、44、46或47中任一个的氨基酸序列。
19.根据段落15所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含seq id no:14、17、18、44、46或47中任一个的氨基酸序列。
20.根据段落1至8任一项所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白是来自金黄色葡萄球菌的h1a。
21.根据段落20所述的融合蛋白，其中所述h1a包含seq id no.19的氨基酸序列或与seq id no.19至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
22.根据段落21所述的融合蛋白，其中所述h1a蛋白被修饰使得：
a.所述氨基酸序列包含在seq id no.19的位置h35处或在与seq id no.19至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处的氨基酸置换，所述置换是任选地h35l；
c.所述氨基酸序列包含在seq id no.19的位置h48和g122处或在与seq id no.19至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处的氨基酸置换，其中所述置换任选地分别是h至c和g至c。
23.根据段落20至22中任一项所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白包含seq id no:20的氨基酸序列或与seq id no:20至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
24.根据段落1至8或20至23中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含(i)段落20至23中任一项定义的h1a，和(ii)段落1至6中任一项定义的肽标签。
25.编码根据段落1至24中任一项所述的融合蛋白的核酸。
26.包含根据段落25所述的核酸的表达载体。
27.包含根据段落26所述的载体的宿主细胞。
28.一种蛋白-多糖缀合物，其包含根据段落1至24中任一项所述的融合蛋白，其中所述蛋白与多糖缀合形成缀合物。
29.根据段落28所述的缀合物，其中所述多糖是细菌荚膜多糖。
30.根据段落28或段落29所述的缀合物，其中所述缀合物是生物缀合物。
31.一种纯化根据段落1至24中任一项所述的融合蛋白或根据段落28至29中任一项所述的缀合物的方法，所述方法包括离子交换层析步骤。
32.根据段落31所述的方法，其中所述融合蛋白中的所述肽标签用于使所述融合蛋白与所述离子交换树脂结合。
33.一种纯化目标蛋白的方法，所述方法包括(i)产生包含所述目标蛋白和与离子交换树脂结合的肽标签的融合蛋白，和(ii)通过离子交换层析纯化所述融合蛋白。
34.一种纯化目标蛋白的方法，其包括对所述蛋白进行离子交换层析，其中所述蛋白已经通过在n或c末端添加肽标签而被修饰。
35.根据段落33或段落34所述的方法，其中所述肽标签用于使所述融合蛋白与所述离子交换树脂结合。
37.根据段落36所述的方法，其中
n’是2至6的整数，包括端值。
38.根据段落33至37中任一项所述的方法，其中所述肽标签的长度是4至20个氨基酸。
39.根据段落38所述的方法，其中所述肽标签的长度是4至12个氨基酸。
40.根据段落33至39中任一项所述的方法，其中所述肽标签包含seq id no 4-6、8或9中任一个的氨基酸序列。
41.根据段落33至40中任一项所述的方法，其中所述肽标签由seq id no 4-6、8或9中任一个的氨基酸序列组成。
42.根据段落33至41中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白进一步在所述目标蛋白和所述肽标签之间包含接头。
43.根据段落42所述的方法，其中所述接头包含gg、gs、ss、sg或ggsgg。
44.根据段落1至24任一项所述的融合蛋白，或根据段落31至43中任一项所述的方法，其中所述离子交换层析是阳离子交换层析。
在阳离子交换柱上纯化携带不同标签的hla-cp5
修饰大肠杆菌菌株w3110以产生金黄色葡萄球菌荚膜多糖cp5。用编码pgib的质粒(pgvxn1221)和从genecust获得的相应的编码h1a的质粒转化该菌株。根据标准程序，使用包含酵母提取物和大豆蛋白胨的复合培养基，使菌株在2l容器中的6-包装发酵罐系统中生长。阿拉伯糖和iptg分别用于诱导h1a和pgib。通过离心进行收获并在-20℃下冷冻细胞团块直至进一步使用。用渗透压休克方法从对应于1ml发酵罐体积的细胞团块中获得周质提取物。为此，将细胞重悬于25％蔗糖，100mm edta，200mm tris，ph 8的溶液中，在冰上孵育30分钟。为了休克细胞，将离心后获得的团块重悬于冷h2o中。将上清液保持在rt直至进一步使用为止。
5.5)洗涤珠子2次。用1.6ml缓冲液a稀释800μl单独的渗透压休克样品并与层析树脂混合。将混合物在rt孵育20分钟。在培养期间将所述管手动摇动4-5次。将离心样品的上清液标记为流通(ft)。用800ml缓冲液a洗涤珠子3次。弃去洗涤级分。通过施加300ml缓冲液b(20mm柠檬酸钠，500mm氯化钠，ph 8.0)中，随后在4℃下再孵育20分钟。再次旋转沉降细胞，并将上清液上样至1ml阳离子交换柱上，并通过梯度洗脱回收生物缀合物。通过4-12％sds-page将蛋白从洗脱部分中分离并印迹到硝酸纤维素膜上，并通过抗-h1a抗体进行检测，或将凝胶直接用simplyblue safe stain(安全染料)进行染色。结果示于图2(有标签)和图3(没有标签)中。
8.5)中并在4℃下旋转20分钟。将细胞沉淀并重悬浮于7.5ml渗透压休克缓冲液(10mm tris-hcl ph8.0)中，随后在4℃下再孵育30分钟。通过离心再次使细胞旋转沉降，回收上清液并用0.2微米过滤器过滤。用5m氯化钠溶液补充2ml滤液至50mm的终浓度，并用1m柠檬酸调节ph至5.5。通过在4℃下以14000rpm离心5分钟使样品旋转沉降。用1ml阳离子交换树脂(nuvia 5.5洗涤柱子，通过在10个柱体积中对20mm柠檬酸盐，500mm nacl，ph 5.5应用梯度来洗脱生物缀合物。收集的流通和洗涤级分为500微升，洗脱级分的体积为350微升。用15微升4倍浓缩的laemmli缓冲液补充45微升的层析级分以获得终浓度为62.5mm的tris-hcl ph