要点高中化学实验常用仪器 要点高中化学实验常用仪器 要点高中化学实验常用仪器 精心整理 化学实验常用仪器 类 仪器名称 主要用途 使用方法和注意事项 别 可 试管 用来盛放或溶解 ①可直接加热，用试管夹夹在距试管口1/3 直 少许药品、常温或 处。 接 加热状况下进行 ②放在试管内的液体，不加热时不超出试管 加 少许试剂反应的 容积的l/2，加热时不超出l/3。 热 容器，可用于制取 ③加热后不可以骤冷，防范炸裂。 或采集少许气体。 ④加热时试管口不对付着任何人；给固体加 热时，试管要横放，管口略向下倾斜。 坩埚 主要用于固体物 一般为瓷质。把坩埚放在三脚架上的泥三角 (坩埚钳、 质的高温灼烧。 上直接加热。取、放坩埚时应用坩埚钳。定 泥三角、 量实验时应在干燥器中冷却。 三脚架) 蒸发皿 蒸发或浓缩溶液 可直接加热，但不可以骤冷。 或结晶。 盛液量不该超出蒸发皿容积的 2/3，结晶时， 近干时可停止加热。 取、放蒸发皿应使用坩埚钳。加热后的蒸发 皿要放在石棉网上冷却。 燃烧匙 少许固体燃烧的 遇能与Fe、Cu反应的物质时要在匙内铺细 反应器。 砂。 隔 烧杯 用作配制溶液和 加热时应搁置在石棉网上，使受热均匀。 网 较大批剂量的反 溶解物质用玻璃棒搅拌时，不可以涉及杯壁或 可 应容器，在常温或 杯底，反应液量不超出容积的 2/3，加热时 加 加热时使用。（水 不超出1/2。 热 浴加热） 须注意常用规格的采纳（如配 100mL溶 液）。 烧瓶： 用于试剂量较大 圆底烧瓶和蒸馏烧瓶可用于加热，加热时要 可分为圆 而又有液体物质 垫石棉网，也可用于其余热浴（如水浴加热 底烧瓶、 参加反应的容器， 等）。 平底烧瓶 可用于装置气体 液体加入量不要超出烧瓶容积的2/3,加热 和蒸馏烧 发生装置。蒸馏烧 时许多于烧瓶容积的1/3，蒸馏时温度计水 瓶。 瓶用于蒸馏以分 银球应放在支管口处并加碎瓷片防暴沸。 注意圆底 离互溶的沸点不 烧瓶与蒸 同的物质。 馏烧瓶的 差别。 不 锥形瓶 中和滴定反应器 液体不超出容积的1/3，中和滴准时应用右 能 及蒸馏接受器。 手振荡，（且只振荡不搅拌）。 加 集气瓶 采集或储存少许 瓶口磨砂，用磨砂玻片涂凡士林封盖。燃烧 热 气体及气体间的 时有固体生成时，瓶底应加少许水或铺少许 反应，安全瓶、量 细砂，不可以加热，盛不一样密度的气体搁置时 气装置。 瓶口方向不一样。 须防范倒吸。 精心整理 试剂瓶 广口：盛固体药品 棕色瓶盛见光易变质药品；盛碱液时应橡皮 启普发生 细口：盛液体药品 塞。 固+液 不加热 气 不可以用于激烈的放热反应和激烈放出气体 器 体 的反应；使用条件是块状固体和液体不加热 制难溶气 如何检验气密性：将导气管上的活塞关闭， 球形漏斗中注入必定量的水，使水面达到球 形漏斗的球体部位。停止加水后，水面能停 留在某一地址不再降落，此时球形漏斗中的 水面高度与容器下部半球体内的水面高度保 持较大的液面差，说明不漏气； 计 容量瓶 用于精确配制一 使用前检查它能否漏水。用玻璃棒引流、用 量 定体积、必定物质 胶头滴管定容、与凹液面相切。只好配制容 仪 的量浓度的溶液 量瓶上规定容积的溶液。容量瓶的容积是在 器 的仪器 20℃时标定的，转移到瓶中的溶液的温度应 在20℃左右。不作反应器，不行加热，瓶 塞不可以互换，不宜储存配好的溶液。 温度计 丈量液体或气体 丈量时不可以超出它的最高量程，不可以当搅拌 的温度 棒，要注意水银球的正确搁置地址，读数时 应平视。 托盘天平 称量物质的质量， 称量前先调零，左物右砝。称量干燥的固体 精度为0.1g。 药品应放在纸上称量。易潮解、有腐化性的 药品（如NaOH），一定放在玻璃器皿里称 量。取用砝码应用镊子夹取，先加质量大的 砝码，再加质量小的砝码。称量达成后，应 把砝码放回砝码盒中，把游码移回零处。 滴定管 用于正确量取一 刻度由上而下，有0刻度，但0不在最上， （酸式、 定体积液体的仪 最大不最下（而是与最上最下有一段距离）， 碱式） 器（精度： 酸式滴定管装酸性溶液和强氧化性溶液，碱 标有详尽 0.01mL） 式滴定管装碱性溶液。装液前要用洗液 使用温 （K227）、水挨次冲洗干净，并要用待 CrO 度。 装的溶液润洗滴定管。调整液面时，应使滴 管的尖嘴部分充满溶液，使液面保持在“0” 或“0”以下的某必定刻度。读数时视野与 管内液面的最凹点保持水平。 量筒 大概量取必定体 刻度由下而上，无“0”刻度；采纳时应注意 标有详尽 积的液体。 规格(大而近)；不可以加热和量取热的液体， 使用温 精度为：0.1mL 不可以作反应容器，不可以在量筒里稀释溶液。 度。 量液时，量筒一定放平，视野要跟量简内液 体的凹液面的最低处保持水平，再读出液体 体积。 热 酒

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1、(共10套)高中化学竞赛测试真题汇总附答案高中化学竞赛试题（一）翻印无效第1题（12分）最近出版的“重大发现记实”中，Cute教授发表了关于外星文明遗迹的研究结果。他认为外星人与人类非常相似，他们可能在亿万年前来过地球，留下了非常奇异的碑记。一些碑文已经破译被证明是外星人当地大学的大学生所用的普通化学教科书的几章。这些内容的最初几行就相当今人，看上去象是那个奇妙的世界里的物质定律，与我们的星球所遵循的规律不同。特别是原子结构也用四个量子数来描述，只有一个重大的区别：

2、表相关研究，一旦他找到了财政支持，将继续他的破译工作并描述出X星球上的周期表和一些基础化学内容。然而以揭示的碑文内容就足以预见一些重要事实。1-1 试创造出X周期表的前两个周期，为简便起见，用我们的化学符号来表示与我们原子有相同电子的X原子；1-2 猜测在那里可用作洗涤和饮用的X水可能是什么？写出全部可能，并说明理由。依据你所构造的X周期表，写出他的化学式。1-3 写出“甲烷（X的氢化物）在氧气中燃烧”的反应，这是给人类提供能量和热源的主要过程；解释你选择X元素的原因？第2题（13分）光气学名“碳酰氯”，化学式COCl2，是窒息性毒剂之一。2-1    

3、   光气化学性质活泼，具有酰卤的典型反应，易发生水解、氨解和醇解。（1）光气与足量乙醇反应所得产物的化学名称是 ；（2）光气与足量氨气反应的化学方程式 ；（3）足量苯在AlCl3催化剂作用下与光气反应所得产物的结构简式 ；（4）光气与苯胺分两步反应可得异氰酸苯酯，中间产物的结构简式是 ，异氰酸苯酯的结构简式是

BTC可在一定条件下分解产生3mol光气，所以又被称为“三光气”。工业上可以利用碳酸二甲酯的氯代反应制备BTC。BTC的反应活性与光气类似，可以和醇、醛、胺、酰胺、羧酸、酚、羟胺等多种化合物反应，因此低毒性的BTC在化学反应中完全可替代剧毒（被禁用）的光气合成相关的化工产品。（1）（1）BTC分子中所有氯原子都等价，试写出结构简式（2）除毒性外，BTC比光气还有什么优点？（2）2-4 2004年6月15日福建省物质结构研究所（简称物构所）一下属企业，因实验操作不当造成有毒光气泄漏。造成人死亡，260多

6、的钠盐进行实验的原因是3-3       B9H92离子可通过B10H102离子的热分解得到。已知B9H92为三角棱柱的三个面上带三个“帽子”，而B10H102的结构为上下两个四边形在上下各带一个“帽子”。两种离子围成的封闭多面体均只有三角形面。则B9H92离子较B10H102离子

8、的相互作用中扮演着重要的角色。非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性（Hydrophobicity），非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应。5-1 有关相似相溶原则可以用热力学自由能的降低来理解。（G0；GHTS，式中是焓变，代表降低体系的能量因素；是体系熵增的因素。在常温下（25° C），非极性溶质溶于水焓的变化（H）通常较小，有时甚至是负的，似乎是有利于溶解的；但实际上溶解度不大！请分析原因。5-2 疏水基团之间的相互作用通常被认为是没有方向性的，但是最近对剑桥晶体结构数据库（

9、CSD）和蛋白质晶体结构数据库（PDB）的研究发现，疏水作用是有方向倾向性的。请分析富电子的吲哚芳环与苯环、缺电子的恶唑环与苯环的可能接触方式，画出示意图。5-3 下面的研究有助于进一步揭示疏水效应和疏水作用的本质。芳香化合物在水中的溶解度其实也不是很小，这取决于相互间的氢键作用，该氢键是因为什么而产生？_；Na，K 等阳离子能与有些芳香化合物很好的互溶取决于 。第6题（10分）今有一金属卤化物A，在水溶液中完全电离，生成一种阴离子和一种阳离子，个数比为41。取4.004gA溶于水，加入过量AgNO3溶液，生成2.294g白色沉淀。经测定，阳离子由X和Y两种元素构成，结构呈正方体状，十分对称。

10、任意两个相离最远的X原子的连线为此离子的三重轴，任意两个相离最远的Y原子的连线为此离子的四重轴（n重轴表示某物质绕此轴旋转360°/n的角度，不能察觉其是否旋转过）。6-1 写出A的化学式（阴阳离子分开写）6-2 写出X和Y的元素符号、6-3 在右框中画出A溶液中阳离子的结构：6-4 小明把一种常见含X的二元化合物的晶胞去掉所有的X原子，发现剩余部分与A溶液中阳离子的结构竟十分相似。这种常见二元化合物是。6-5 你认为A溶液中阳离子中，同种原子间存在着什么样的作用力，并简略说明你的依据：第7题（6分）科学家预言，燃料电池将成为20世纪获得电力的重要途径。因为燃料电池有很多的优点。它的

11、能量转化率比火力发电高一倍多，环境污染少，节能。按燃料电池化学成分的不同，有氢、一氧化碳、联氨、醇和烃等类型；按电解液的性质不同，可分为碱性、酸性、熔盐和固体电解质、高聚物电解质、离子交换膜等类型。以渗透于多孔基质惰性导电物材料为电极，用35%50%KOH为电解液，天然气和空气为原料，构成的电池为碱性燃料电池。请写出：阳极反应： ；阴极反应： ；电池总反应式： 。用两种或多种碳酸盐的低熔点混合物为电解质，例如Li2CO3 52%、Na2CO3 48%，采用吸渗锦粉作阴极，多孔性氧化镁作阳极，以含一氧化碳为主要成分的阳极燃料气，混有CO2的空气为阴极燃气，在650电池中发生电极反应，这种电池在国

12、外已经问世。请写出有关的反应式。阳极反应： ；阴极反应： ；电池总反应式： 。第8题（9分）有强烈气味的无色液体A在100蒸馏时，其组成不变。此液体的蒸气密度（相对于空气）随温度而改变，100时为1.335，20时为1.50。若将液体加到新制的氢氧化铜（取化学计量的碱）中，沉淀溶解，形成淡蓝色溶液。将1g液体A与过量浓硫酸在一起加热时，放出密度（相对于空气）为0.966的气体360mL，若将1g液体A加到含过量MnO2的硫酸溶液中，则放出同样体积的、比前一种气体重1.57倍的另一种气体（体积均以标准状态计）。8-1 确定液体A的组成，并以必要的计算和反应的化学方程式证明答案。8-2 为什么蒸馏

13、时此液体的组成不变？为什么它的蒸气的相对密度随温度的变化而变化？第9题（14分）日本的白川英树等于1977年首先合成出带有金属光泽的聚乙炔薄膜，发现它具有导电性。这是世界上第一个导电高分子聚合物。研究者为此获得了2000年诺贝尔化学奖。9-1 写出聚乙炔分子的顺式和反式两种构型。再另举一例常见高分子化合物，它也有顺反两种构型（但不具有导电性）。9-2 若把聚乙炔分子看成一维晶体，指出该晶体的结构基元。9-3 简述该聚乙炔塑料的分子结构特点。9-4 假设有一种聚乙炔由9个乙炔分子聚合而成，聚乙炔分子中碳碳平均键长为140pm。若将上述线型聚乙炔分子头尾连接起来，形成一个大环轮烯分子，请画出该分子

如果3个乙炔分子聚合，可得到什么物质。并比较与由9个乙炔分子聚合而成的大环轮烯分子在结构上有什么共同之处。第10题（8分）称取含铅试样0.500g，用HNO3溶解，然后用1mol/LNaOH溶液将试液调至中性。加入足量K2CrO4溶液，铅完全生成铬酸铅沉淀；将沉淀过滤洗净，用酸溶解，调节溶液为酸性；再加入足量的KI溶液，释放出I2；用0.100mol/LNa2S2O3溶液滴定至终点时，消耗30.0mL。10-1 写出上述、步主要离子反应方程式；10-2 写出该含铅试样中Pb的质量分数计算式和结果。高中化学竞赛试题（二）翻印无效第1题（3分）下表是摘自当前高中化学教材附录中的相对

15、原子质量（部分）HHeLiBeBCNO1.12.715.9994FNeNaMgAlSiPS18.4..上表元素（及更多元素）中，有的元素的相对原子质量（原子量）的有效数字的位数多达79位，而有的元素的相对原子质量的有效数字位数少至34位，为什么？第2题（12分）将H2O2慢慢加入到SbF5的HF溶液中得一白色固体A，A是一种盐类，其阴离子呈八面体结构。2-1 A的结构简式 ，生成A的化学方程式 。

16、2-2 A不稳定，能定量分解，B是产物之一，其中亦含有八面体结构，B的结构简式为 。2-3 若将H2S气体通入SbF5的HF溶液中，则得晶体C，C中仍含有八面体结构，写出C的结构简式 。生成C的化学反应方程式是 。2-4 将H2O2滴入液氨中得白色固体D，D是一种盐，含有正四面体结构，写出D的结构式 和生成反应方程式 。比较H2O2和H2S的性质异同 。第3题（8分）有机物X具有旋光活性，其分子由C、H、O、N 4种元素组成，其中C、H、O的原子个数比是352；工业上可以用A和B以物质的量14通过取代反应制备X；X能与4倍其物质的量的NaOH反应，并能与Ca2等与大部分金属离子11络合，所得螯

。3-2      写出满足条件的全部X的结构简式，分别命名和计算光学异构体的个数。第4题（12分）据中国制药报道，化合物F是用于制备抗“非典”药品（盐酸祛炎痛）的中间产物，其合成路线为：4-1 请写出有机物字母代码的结构简式。4-2 第、步反应的顺序能否填倒，说明理由。4-3 写出DEF的化学方程式，并用系统命名法命名F。4-4 第步反应的反应类型是 。4-5 E在一定条件下可聚合成热固性很好的功

18、能高分子，写出合成此高聚物的化学方程式。第5题（6分）现在，我们来研究AgNO3溶液和(NH4)2S溶液之间的反应。将AgNO3溶液和(NH4)2S溶液混合，会发生反应。若在31时，将5mL 2mol/L AgNO3溶液和5mL接近饱和的(NH4)2S溶液分别放在2个青霉素瓶中，用一段60cm长充满饱和KNO3溶液的一次性医用输液管作盐桥，如图所示：经观察，电解一段时间后，二个青霉素瓶中都有新物质生成。5-1 插入AgNO3(aq)的碳棒上有 ，是因为有 生成；插入(NH4)2S溶液的碳棒附近的液体显 色，是因为有 生成；上述电解的离子反应方程式为 。5-2

19、溶液液面上分别用1cm厚的石蜡油封闭液面的原因是第6题（20分）A物质是实验室一种无色有毒的挥发性液体，由X、Y两种短周期元素组成。A在空气中极易着火生成B气体和C气体；A不溶于水，但加热到423K可以和水反应，生成B气体和D气体，D只含两种元素，其中一种是Y。在交流放电的情况下，分解生成E气体、F固体两种物质，E物质和B化学式量几乎相等，含Y元素约72.7%；F是环状单质分子，具有冠状结构，易溶于A，F的式量约是C的4倍。E可在液氮条件下与HBr于77K生成含双键结构的物质G，冷却至室温可得G的环状三聚体H。6-1 写出A、B、C、D、E、F、G、H的结构简式。6-2 用X射线衍射法测得F的

20、晶体为正交晶系，晶胞参数a1048pm，b1292pm，c2455pm。已知该物质的密度为2.07g·cm3。计算每个晶胞中F分子的数目。6-3 自发现富勒烯以来，其神奇的结构和性能引起了人们对碳原子团簇广泛和深入的研究。除了碳原子团簇之外，其它元素的原子团簇是否也具有类似碳原子团簇的奇异的特性，这是个十分有趣的研究课题。F物质有很多同分异构体，在实验手段受到各种条件的限制时，理论研究是一种重要的补充。厦门大学化学系对F物质的原子团簇进行了理论计算，发现除了冠状结构外还有多种结构。其中一种X具有2次对称轴，以及两个包含对称轴的对称面，一配位和三配位原子数目相等；另外一种Y是一种椅式结

21、构原子团簇增加2个原子形成，也具有二次对称轴，对称面和对称轴垂直。请画出这两种结构的原子团簇。6-4 五氟化砷AsF5（2.93g）和上述物质F（0.37g）用四氮化四硫S4N4（0.53g）在液态SO2溶剂中发生完全的反应，溶剂和挥发性产物被泵抽出后得黄色固体残留物L（3.08g），分析J知其含有：As 28.04%，F 42.70%，N 5.25%，经分析L是离子化合物，阴离子为正八面体结构，阳离子为两种元素组成，结构是直线形。固体L（0.48g）溶于液态二氧化硫，和叠氮化铯CsN3（0.31g）完全反应，收集应释放出得氮气于66.5kPa、298K为67.1cm3。反应混合物过滤得难溶蓝

22、黑色纤维状固体J（0.16g）。分析J知其含有2种元素，其中含N 30.3%。红外光谱、X射线粉末衍射结果表明抽出SO2后残留物是六氟砷（V）酸铯。（1）L的实验式是什么？（2）提出L的结构式；（3）写出配平的生成L的方程式；（4）1mol L发生转化时生成氮气的物质的量；（5）J的化学式；（6）写出n mol

C2H5OH(g)的第8题（7分）苯巴比妥是1903年就开始使用的安眠药，其合成路线表示如下。请在相应的方格中写出AF和苯巴比妥的结构：第9题（14分）锂电池由于其安全可靠的性能，体积小、质量轻、高效能及可逆等卓越品质被广泛应用于移动电话、笔记本电脑、数码相机等便携式电子器材中。 下图为锂电池工作原理图，阴极材料由LiMO2（M=Co, Ni

24、, V, Mn）构成，阳极材料由石墨构成，阴、阳两极之间用半透膜隔开，充电时锂离子由阴极向阳极迁移，放电时则相反，电池可表示为：() Cn / LiClO4 / LiMO2 (+)9-1 写出锂电池充放电时的可逆电极反应。9-2 根据上图所示的LiMO2的尖晶石结构，写出氧的堆积方式，并指出Li和M占据何种空隙，画出以氧为顶点的一个晶胞。9-3 锂离子在阳极与石墨形成固体混合物，试推测并画出锂离子嵌入石墨的可能结构。9-4 早期的阳极材料用的是锂金属, 试指出锂金属作阳极材料的不足, 并说明还可以用什么物质替代石墨作阳极材料?第10题（6分）称取含有KBrO3、KBr及惰性物质试样1.000g

25、，溶解定容于100mL容量瓶中。移取25.00mL试液，在H2SO4介质中以Na2SO3还原BrO3至Br，调至中性，用0.1010mol/LAgNO3滴定至终点，用去10.51mL，另取25.00mL试液，用硫酸酸化后，加热赶去Br2，再调至中性，滴定剩余的Br，用去上述的AgNO3标准溶液3.25mL。计算试样中KBrO3、KBr 的质量分数。（已知KBrO3、KBr的摩尔质量分别为167.0g/mol，119.0g/mol）高中化学竞赛试题（三）第1题（9分）某一简易保健用品，由一个产气瓶、A剂、B剂组成，使用时，将A剂放入产气瓶中，加入水，无明显现象发生，再加入B剂，则产生大量的气体供

26、保健之用。经分析，A剂为略带淡黄色的白色颗粒，可溶于水，取少量A溶液，加入H2SO4、戊醇、K2Cr2O7溶液，戊醇层中呈现蓝色，水层中则不断有气体放出，呈现蓝绿色。B剂为棕黑色粉末，不溶于水，可与KOH和KClO3共溶，得深绿色近黑色晶体，该晶体溶在水中又得到固体B与紫红色溶液。回答下列问题：1-1       填表：主要成分在保健用品中的作用A剂B剂1-2       写出各过程的方程式。1-3     

27、;  在A剂、B剂的量足够时，要想在常温下使产气速率较均匀，你认为关键是控制什么？第2题（8分）离子晶体X是由三种短周期元素组成，三种短周期元素的简单离子的核外电子排布相同，晶胞参数a780pm，晶胞中阴离子组成立方最密堆积，阳离子（r102pm）占据全部八面体和四面体空隙。2-1       写出X的化学式

28、160; 计算晶体X的密度；2-4       X在化工生产中有什么用途；2-5       另有一种晶体Y，其阴离子也组成立方最密堆积，且与X的阴离子互为等电子体，而阳离子与X的阳离子相同，但只占据全部四面体空隙，请写出Y的化学式。第3题（8分）“摇头丸”中含有氯胺酮成分。氯胺酮是国家监管的药品，它具有致幻作用。氯胺酮在一定条件下发生下列一系列转化：3-1 写出氯胺酮的分子式 ；系统命名为 。氯胺酮 （填“溶”或“不溶”，下同）于水， 于乙醚。

29、3-2 上述转化过程中发生取代反应的是 ；反应的条件是 。3-3 C的结构简式可能为C1： 、C2： 。其中最有可能的是_。第4题（7分）测定硫磺的纯净度，可采用如下的方法：准确称取一定量的硫磺，与已知浓度和质量的氢氧化钠溶液（过量）（反应），直到硫磺完全溶解。冷却至室温，缓缓加入15%的过氧化氢溶液至过量，并不断摇动（反应，硫元素全部转化为S()）。反应完成后，加热至沸腾，冷却至室温，加23滴酚酞，用已知浓度的盐酸滴入，至溶液刚好褪色。记录盐酸的消耗量。4-1 写出反应、的各步化学方程式。4-2 简述这一方法如何能知道硫磺的纯度？（不必列式计算，只需把原理说明）4-3 “反应完成后，加热至沸

30、腾”这一操作是否必要，为什么？第5题（12分）无机化合物A由同主族的短周期元素X、Y及Cl组成，其中Cl元素的质量百分含量为61.18%，可由氯化物B（含氯85.13%）和C（含氯66.27%）以物质的量11反应得到。用冰点测定仪确定其摩尔质量为（340±15）g/mol。A只有两种键长：XY 160pm，YCl 198pm。A显示出非常有趣的物理性质：速热可在114时熔化，256时沸腾；而缓慢加热，约在250时才观察到熔化。缓慢加热所得到的熔化物冷却固化时得到橡皮状树脂（D，线形高分子化合物）。256蒸馏该熔化物，得一液体，它可在114固化。5-1 写出元素X、Y的符号；5-2 写

31、出化合物A、B、C、D的化学式；5-3 画出A、D的结构简式；5-4 估算相邻氯原子间的距离；5-5 预测聚合物D是否有导电性，说明理由。第6题（16分）根据下面的合成路线回答A（烃）BC（格氏试剂）D（氟代乙酸乙酯）CEFGGCHIJ（K）6-1 请命名产物K；并用*标出手性碳原子6-2 写出AB；BC的反应条件6-3 写出AJ各物质的结构简式6-4

与CO2(g)的分压分别为3167Pa与30.4Pa，将纯NaHCO3固体放入大气中让其发生上述分解反应。（1）问此时该分解反应的比大还是小？为什么？（2）用QP与比较说明NaHCO3固体迅速分解还是稳定存在？（3）用吉布斯自由能判据说明NaHCO3固体迅速分解还是稳定存在？ 视H2O(g) 与CO2(g)为理想气体第8题（10分）无机橡胶是一类

33、橡胶状的弹性体，磷腈聚合物为典型的代表，它由五氯化磷和氯化铵在四氯乙烯溶剂中反应制得，经减压蒸馏可将聚合度为34得分子分离出来，将三聚产物在真空管加热至300左右，则开环聚合成具有链状结构的氯代磷腈高聚物，其分子量大于2000，它是无色透明不溶于任何有机溶剂的橡胶状弹性体。无机橡胶在潮湿空气中弹性会降低，改性无机橡胶具有优良的耐水性、耐热性、抗燃烧性及低温弹性好等优良的特性。试写出：8-1 生成聚磷腈的化学反应方程式。8-2 写出聚磷腈的基本结构单元及三聚磷腈的结构式。8-3 三聚磷腈加热聚合的化学方程式。8-4 无机橡胶在潮湿的空气中弹性降低的原因是什么。8-5 采用什么样的方法才能有效的防

34、止其遇潮弹性降低。8-6 试说出改性无机橡胶的两个用途。第9题（8分）本题涉及4种组成不同的配合物，它们都是平面正方形结构。9-1 PtCl2·2KCl的水溶液与二乙硫醚（Et2S）反应（摩尔比1：2）得到两种结构不同的黄色配合物，该反应的化学方程式和配合物的立体结构是：9-2 PtCl2·2KCl的水溶液与足量Et2S反应获得的配合物为淡红色晶体，它与AgNO3反应（摩尔比1：2）得到两种组成不同的配合物，写出上述两个反应的化学方程式第10题（10分）维生素C又称抗坏血酸，广泛存在于水果、蔬菜中，属于外源性维生素，人体不能自身合成，必须从食物中摄取。其化学式为C6H8O6

35、，相对分子量为176.1，由于分子中的烯二醇基具有还原性，能被I2定量地氧化成二酮基，半反应为：C6H8O6 = C6H6O6 + 2H+ + 2e j y = 0.18 V因此，可以采用碘量法测定维生素C药片中抗坏血酸的含量。具体实验步骤及结果如下：（1）准确移取0.01667 mol/L的K2Cr2O7标准溶液10.00 mL于碘量瓶中，加3 mol/L H2SO4溶液10 mL，10% KI溶液10 mL，塞上瓶塞，暗处放置反应5 min，加入100 mL水稀释，用Na2S2O3标准溶液滴定至淡黄色时，加入2 mL淀粉溶液，继续滴定至溶液由蓝色变为亮绿色。平行三次实验，消耗Na2S2O3

36、标准溶液平均体积为19.76 mL。（2）准确移取上述Na2S2O3标准溶液10.00 mL于锥瓶中，加水50 mL，淀粉溶液2 mL，用I2标准溶液滴定至蓝色且30 s不褪。平行三次实验，消耗I2标准溶液平均体积为10.15 mL。（3）准确称取0.2205 g的维生素C粉末（维生素C药片研细所得）于锥瓶中，加新煮沸过并冷却的蒸馏水100 mL，2 mol/L HAc溶液10 mL，淀粉溶液2 mL，立即用I2标准溶液滴定至蓝色且30 s不褪，消耗12.50 mL。（4）重复操作步骤（3），称取维生素C粉末0.2176 g，消耗I2标准溶液为12.36 mL；称取维生素C粉末0.2332 g

37、，消耗I2标准溶液为13.21 mL。根据以上实验结果计算出该维生素C药片中所含抗坏血酸的质量分数。高中化学竞赛试题（四）翻印无效第1题（8分）根据提供的信息写出相应的化学方程式：1-1 据认为“红巨星”星体内部发生着合成重元素的中子俘获反应，例如Zn可以俘获1个中子形成A，过剩的能量以光子形式带走；A发生衰变转化为B。试写出平衡的核反应方程式。1-2 铍与某些普通配体形成的配合物相当稳定，比如铍的化合物A为无色可升华的分子型化合物，易溶于氯仿并可从氯仿溶液中重结晶。A物质中心氧原子周围按四面体方式排布4个Be原子，Be原子两两间又被醋酸根所桥联。该物质可以通过碳酸铍与醋酸反应制备，请写出该制

38、备反应的化学方程式；1-3 ClF3是比F2更有效的氟化剂，遇有机物往往爆炸，能燃烧石棉，能驱除许多金属氧化物中的氧。比如气态ClF3与Co3O4反应，作为还原剂的元素有两种，物质的量之比为14，请写出反应方程式。第2题（11分）上世纪末，中国科大的化学家把CCl4(l)和Na混合放入真空容器中，再置于高压容器中逐渐加热，可得一些固体颗粒。经X射线研究发现：该固体颗粒实际由A和B两种物质组成，其中A含量较少，B含量较多。试回答下列问题：2-1        CCl4和Na为何要放在真空容器中？随后为何要置于高压容器中？2-2

写出合成的中间产物B、C、E、F、G、H的结构简式3-3 确定无机试剂a、b、c、d第4题（12分）钢铁表面发蓝（或发黑，在钢铁表面形成一层致密的氧化物Fe3O4）可提高其耐磨、耐蚀性能。其原理是：在NaOH溶液中，将铁粉溶解在NaN

41、O2溶液中，除水之外，还可产生A和C。其中C为气体，能使湿润的红色石蕊试纸变蓝。A能在过量的NaNO2溶液中继续反应，生成B和C。A和B的溶液能继续反应，生成Fe3O4。经研究发现：A和B的焰色反应均为黄色，其导电性实验均为K2SO4型。生成物中A与C、B与C的物质的量之比均为31。回答下列问题：4-1 写出并配平化学反应方程式。4-2 实践中发现适当提高温度或增大NaNO2溶液的浓度有利于氧化膜增厚，但加大NaOH溶液浓度对膜层厚度影响不大。试说明原因。4-3 发蓝层遇光气（COCl2），若不及时清洗，则发蓝层的完整性将被破坏。写出有关的化学反应方程式。4-4 有一种隐形材料D可由B与Zn(

42、NO3)2 反应生成，也可用以硝酸铁、硝酸锌、氢氧化钠等为原料的水热合成法。请确定D的化学式，并判断上述制备D的反应是否属于氧化还原反应。此法所得产品D能够隐形的原因是什么？第5题（11分）卡宾又称为碳烯，是某些有机反应的中间物质，碳原子最外层有两个电子没有参与成键。由于其结构的特殊性，所以有很高的活性。卡宾主要分单线态和三线态两种状态，三线态稳定性最差。然而，2001 年Nature 杂志报道了日本研究人员偶然获得了迄今为止最稳定的三线态卡宾（如图，实心圆点表示电子），其在室温溶液中半衰期高达19 分钟，比1999 年报道的最长半衰期三线态卡宾的半衰期长10 分钟。三线态对于形成铁磁性有机材

43、料具有潜在意义，故该偶然发现有可能导致新的有机磁性材料。回答下列问题：5-1 合成中重要的碳烯是二氯卡宾（CCl2），请分析其具有高反应活性的原因。5-2 右图中A 的化学式为_5-3 分子B中所有苯环是否会共平面，为什么？5-4

44、O的生产适宜条件应是 ；6-4 吸收CO的Cu(NH3)2Ac溶液经适当处理后又可再生，恢复其CO的吸收能力以供循环使用，Cu(NH3)2Ac再生的适宜条件是 。第7题（12分）2001年曾报道，硼镁化合物刷新了金属化合物超导温度的最高记录。该化合晶体结构中的一种重复单位如右图所示。镁原子间形成正六棱柱，六个硼原子位于棱柱内。7-1 则该化合物的化学式可表示为 ；7-2 画出该晶体的晶胞示意图（Mg原子在晶胞的顶点）；7-3 Mg原子的配位数是 ，B原子的配位数是 ；7-4 B原子的空间排列方式与 （物质名称）的排列方式类似；并判断Mg、B在平面片层的排列是否为最密排列。7-5 如果将B原子画

45、在晶胞的顶点，在右框中画出此时晶胞的示意图；7-6 上述所画两个晶胞的体积比是 。第8题（8分）近年来，化学家将F2通入KCl和CuCl的混合物中，制得了一种浅绿色的晶体A和一种黄绿色气体B。经分析，A有磁性，其磁矩为2.8B.M，且能被氧化。将A在高温高压下继续和F2反应，可得C，C的阴离子和A的阴离子共价键数不变（阴离子结构对称）。已知A、C中铜元素的质量分数分别为21.55%和24.85%。8-1 试写出AC的化学式，分别指出A、C中铜的化合价和价电子构型。8-2 写出上述化学反应方程式。8-3 简述A、C阴离子形成的原因。第9题（9分）20世纪60年代，化学家发现了一类酸性比100%的

46、硫酸还要强的酸，称之为魔酸，其酸性强至可以将质子给予受体，CF3SO3H就是其中常见的魔酸之一。9-1 试写出CH3CH3与CF3SO3H可能的反应式。 9-2 以上反应所得产物活性均很高，立即发生分解，试写出分解以后所得到的全部可能产物。第10题（11分）1866年H. Rithausen从谷胶的硫酸分解产物中分离出谷氨酸（）。1890年L. Wollf合成并确定了它的结构，1908年池田菊苗从海带的热水提取物中分离出谷氨酸的钠盐（），它才是具有鲜味的成分，即味精。10-1 谷氨酸的电离常数Ka1=6.46×103，Ka2=5.62×105，Ka3=2.14×1

9.67。目前工业上生产味精的方法有水解法、糖蜜提取法、淀粉发酵法及合成法等。当前我国生产的味精主要采用淀粉发酵法。以发酵法生产的工艺流程如下：淀粉葡萄糖发酵谷氨酸铵L谷氨酸谷氨酸钠盐。若生成谷氨酸二钠盐，则不具有鲜味，所以工业生产中控制各阶段的pH是一项关键。（1）（1）Ka1、Ka2、Ka3相对应的基团各是哪个？（2）计算谷氨酸等电点的pH（所谓等电点，就是谷氨酸呈电中性时所处环境的pH）。在下面正确的选项上画圈。A2.19

48、？在下面正确的选项上画圈。A3.22 B4.25 C6.96 D9.67（4）用什么物质脱色？ （1）10-2 味精中有效成分是谷氨酸钠，可用沙伦逊甲醛滴定法测定其含量。准确称取味精1.000g，加蒸馏水溶解后稀释到10.0mL；从中取2.0mL放入100mL锥形瓶中，加入2.0mL 36%的甲醛溶液，加入20mL水。以酚酞为指示剂，用0.1000mol/L的标准NaOH溶液进行滴定，消耗10.80mL。（1）谷氨酸钠与甲醛反应得到化学式为C6H8NO4Na，写出结构简式。（2）加入甲醛的目的是什么？（3）计算该味精中谷氨酸钠的含量。10-3 味精中往往会加入食盐，某学生设计如下实验方案测定N

49、aCl含量：取味精样品5.0g，并溶于蒸馏水；加入足量用稀硝酸酸化的硝酸银溶液，使沉淀完全；过滤；用蒸馏水反复洗涤沉淀多次；将沉淀低温烘干、称量；重复操作3次，计算NaCl含量。另一学生觉得这个实验方案的误差较大，且测定沉淀的质量很不方便。于是他设计了另一个实验方案来测定NaCl的含量。已知AgSCN是难溶于水的沉淀。请简要写出测定NaCl含量的新方案。高中化学竞赛试题（五）第1题（6分）完成下列化学方程式1-1 某校曾发生误将高锰酸钾与红磷相混，造成一死一残的严重事故。试写出这一变化的化学方程式。1-2 在一支试管中，盛少量As2S3和K2S粉末（物质的量之比为12），往其中加入足量硝酸并微

50、热。写出化学反应方程式（用一个化学方程式表示，HNO3还原为NO）1-3 在SnCl2的硫酸溶液中滴入KMnO4至刚好反应完全。写出离子反应方程式。第2题（13分）金属X被喻为“含在口中就熔化的金属”，是1871年俄国化学家门捷列夫在编制化学元素周期表时曾预言的“类铝”、1875年法国化学家布瓦博德朗从闪锌矿中离析出的金属。近年来，X成为电子工业的新宠，其主要用途是制造半导体材料，被誉为“半导体材料的新粮食”。2-1 X的元素符号是 ，电子构型是 。呈现的化合价可能是 和 。2-2 X的化学性质不活泼，在常温下几乎不与氧和水发生反应，但溶于强酸和强碱。写出离子反应方程式。2-3 X的熔点为 （

51、请估计），沸点却高达2403，更奇妙的是X有过冷现象（即熔化后不易凝固），它可过冷到120，是一种低熔点、高沸点的液态范围最大的金属，是金属制造 材料中的千古绝唱。并分析X做该材料时还可能具有哪些性质 。2-4 X不能像普通金属那样任意堆放，也不能盛装在玻璃容器内，试分析可能原因，并提出保存方案。翻印无效第3题（11分）化合物A含硫（每个分子只含1个硫原子）、氧以及一种或几种卤素；少量A与水反应可完全水解而不被氧化或还原，所有反应产物均可溶于水；将A配成水溶液稀释后分成几份，分别加入一系列0.1 mol/L的试剂，现象如下：加入硝酸和硝酸银，产生微黄色沉淀。加入硝酸钡，无沉淀产生。用氨水将溶液

A溶于水稀释至250.0cm3。取25.00cm3溶液加入HNO3和足量的AgNO3，使沉淀完全，沉淀经洗涤、干燥后称重，为1.452g。写出A的化学式。3-6       写出A与水的反应的方程式。若你未在回答以上问题时得到A的化学式，请用SO2ClF代替A。第4题（9分）Ar、Xe、CH4、Cl2等分子能和水形成气体水合物晶体。在这种晶体中，水分子形成三维氢键骨架体系。在骨架中有空穴，它可以容纳这些气体小分子形成笼型结构。4-1 甲烷的气体水合物晶体成为可燃冰。已知每1

一种草地早熟禾谷氨酰胺合成酶基因ppgs1.1启动子的克隆及其应用
1.本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种草地早熟禾谷氨酰胺合成酶基因ppgs1.1启动子的克隆和应用。

l.)的多年生冷季型根茎-疏丛型禾草，是寒温带地区优良的冷季型草坪草，具有良好的坪用性状和较高的观赏价值。充足的氮素营养是直接影响草坪植物品质的重要因素，作为我国三北区(包括东北、西北和华北)被广泛利用的草坪植物，为保持草地早熟禾草坪的观赏质量需施入大量的氮肥。提高草地早熟禾氮素营养利用效率不但有利于提高其品质和观赏价值，对节约能源、降低污染、保护生态环境也具有重要意义。
3.植物转录水平的基因表达调控主要是由启动子及其贡献的顺式作用调控元件(cis-regulatory elements,cres)控制。启动子cres功能的研究对于转基因植物中外源基因的高效表达方面起着非常重要的作用。在植物的不同生长阶段或者应对各种非生物胁迫时调控相应的基因转录，进一步开发利用启动子可以实现对目的基因准确高效的调控，在基因功能研究和抗逆性种质资源培育中具有巨大的应用潜力。因此，对特定基因启动子区域的分析与研究可以提供许多关于其表达调控的有价值的信息。谷氨酰胺合成酶(glutamin 和谷氨酸(glu)反应，将无机氮形式的nh
转化为有机氮形式的谷氨酰胺(gln)，消除nh
对细胞的伤害，同时提高植物对氮素营养的利用效率。gs同工酶处于高等植物氮素代谢中的中心地位。gs基因启动子却很少有人研究，也没有关于gs基因启动子在草地早熟禾中作用的报道。虽然我国有着丰富的草地早熟禾种质资源，但目前我国商用的草地早熟禾品种绝大多数依赖于进口。氮肥对草地早熟禾的生长和坪用质量至关重要，因此通过遗传改良来提高草地早熟禾氮素利用效率及坪用品质并进行品种推广应用具有重要实际意义。
4.专利公开号cn b，发明名称为《一种克隆草地早熟禾谷氨酰胺合成酶ppgs1基因的方法》，公开了：(1)通过电子克隆获得ppgs1基因的部分cdna序列，长度为1065bp。(2)以cdna序列为靶标序列，设计特异引物，通过rt-pcr技术进行扩增。(3)通过琼脂糖凝胶电泳，回收pcr产物。并将回收的特异产物连接到peasy cloningvector载体上，转化感受态细胞，对阳性克隆进行测序，得到草地早熟禾ppgs1基因的部分cdna序列，与电子克隆长度一致。(4)根据克隆得到的部分cdna序列，设计特异引物，利用clontech公司的smarttm race技术原理进行cdna末端扩增，所获得的ppgs1cdna全长为1451bp。(5)实时荧光定量pcr技术检测表明ppgs1基因具有组织特异表达性。但是该发明专利是克隆ppgs1基因的cdna序列，并不涉及到ppgs1.1基因的启动子。

5.本发明的目的是为了填补现有草地早熟禾ppgs1.1启动子序列研究上的空白，以期为改良草地早熟禾氮素吸收与利用能力和提高草地早熟禾的坪用品质奠定基础。
6.本发明的一种克隆草地早熟禾谷氨酰胺合成酶ppgs1.1基因启动子片段的引物，所述的引物序列如下:
11.包含所述的引物的试剂盒。
12.本发明采用所述的引物克隆早熟禾谷氨酰胺合成酶ppgs1.1基因启动子片段的方法，是按照如下方式进行的：
13.步骤一、提取草地早熟禾的基因组dna；
14.步骤二、以草地早熟禾的基因组dna为模板，采用权利要求1所述的引物进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳，回收pcr产物，即得所述的ppgs1.1基因启动子片段。
15.本发明一种克隆草地早熟禾谷氨酰胺合成酶ppgs1.1基因启动子的引物，所述的引物序列如下：
18.本发明采用所述的引物获取得到的ppgs1.1基因启动子，所述的ppgs1.1基因启动子的核苷酸序列如seq id no.2所示。
19.本发明采用所述的引物克隆早熟禾谷氨酰胺合成酶ppgs1.1基因启动子的方法，它是按照如下方式进行的：
20.以草地早熟禾的基因组dna为模板，采用所述的引物进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳，回收得到1511bp的pcr产物，即得所述的ppgs1.1基因启动子。
21.本发明的有益效果在于：
22.本发明采用草地早熟禾为试验材料，通过染色体步移(genome walking,gw)技术克隆ppgs1.1启动子序列，利用烟草瞬时浸染证明ppgs1.1基因启动子具有行使基因转录的功能，进一步通过花序浸染法转化拟南芥分析ppgs1.1基因启动子的表达模式和转录活性，探究ppgs1.1基因启动子的功能，以期为改良草地早熟禾氮素吸收与利用能力和提高草地早熟禾的坪用品质奠定基础，为提高草地早熟禾品种的抗性和增强草地早熟禾在不利环境中的生存适应能力提供一定的理论依据，也为增强对gs基因的转录调控提供新的见解。
25.图3为ppgs1.1基因启动子片段酶切位点分析图；
27.图5为ppgs1.1基因启动子的克隆载体和表达载体pbi121双酶切目的片段胶回收电泳图；图中，m：dl5000 dna marker(bp)；1：pbi121质粒的酶切；2：启动子序列的酶切；
28.图6为ppgs1.1基因启动子的克隆载体和表达载体pbi12构建图；
29.图7为gus基因在烟草中的表达图；
30.图8为50mg/l卡娜霉素筛选拟南芥抗性苗照片；图中，a图：种子的筛选(圈内为转基因苗)；b图：移至营养土中7天照片；
31.图9为拟南芥抗性苗分子鉴定电泳图；图中，a图：1，gus-pcr产物；2，阴性对照；b图：1，ppgs1.1-pcr产物；2，阴性对照；
32.图10为转基因拟南芥gus染色图；图中，a～d：转基因拟南芥在萌发6d后幼苗茎、根及叶片中gus基因的表达情况；
33.图11为蛋白标准曲线图；
34.图12为荧光标准曲线图；
35.图13为13天龄的转基因拟南芥幼苗照片；
36.图14为gus基因荧光定量分析测试氮胁迫下ppgs1.1启动子启动活性的影响图；图a为硝态氮胁迫图；图b为铵态氮胁迫图。
37.本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
38.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
39.本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
40.具体实施方式一：本实施方式的一种克隆草地早熟禾谷氨酰胺合成酶ppgs1.1基因启动子片段的引物，所述的引物序列如下:
45.具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的ppgs1.1基因启动子片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。其他与具体实施方式一相同。
46.具体实施方式三：本实施方式包含具体实施方式一所述的引物的试剂盒。
47.具体实施方式四：本实施方式采用具体实施方式一所述的引物克隆早熟禾谷氨酰胺合成酶ppgs1.1基因启动子片段的方法，其特征在于：它是按照如下方式进行的：
48.步骤一、提取草地早熟禾的基因组dna；
49.步骤二、以草地早熟禾的基因组dna为模板，采用权利要求1所述的引物进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳，回收pcr产物，即得所述的ppgs1.1基因启动子片段。
50.具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：所述的pcr扩增是分四轮pcr扩增完成的，具体为：
51.第一轮pcr扩增：以草地早熟禾的基因组dna为模板，采用简并引物以及sp1作为引物进行扩增；
52.第二轮pcr扩增：取第一轮pcr扩增产物为模板，采用简并引物以及sp2作为引物进行扩增；
53.第三轮pcr扩增：取稀释100倍第二轮pcr扩增产物为模板，采用简并引物以及sp3作为引物进行扩增；
54.第四轮pcr扩增：取稀释100倍第三轮pcr扩增产物为模板，采用简并引物以及sp3作为引物进行扩增。其他与具体实施方式四相同。
55.具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四或五不同的是：所述的pcr扩增是分四轮pcr扩增完成的，其中，第一轮的pcr扩增体系如下：
第一轮的pcr扩增条件如下：
第二轮的pcr扩增体系如下：
第二轮的pcr扩增条件如下：
第三轮的pcr扩增体系如下：
第三轮的pcr扩增条件如下：
第四轮的pcr扩增体系如下：
第四轮的pcr扩增条件如下：
其他与具体实施方式四或五相同。
具体实施方式七：本实施方式的一种克隆草地早熟禾谷氨酰胺合成酶ppgs1.1基因启动子的引物，所述的引物序列如下：
具体实施方式八：本实施方式采用所述的引物获取得到的ppgs1.1基因启动子，所述的ppgs1.1基因启动子的核苷酸序列如seq id no.2所示。
具体实施方式九：本实施方式用所述的引物克隆早熟禾谷氨酰胺合成酶ppgs1.1基因启动子的方法，它是按照如下方式进行的：
以草地早熟禾的基因组dna为模板，采用所述的引物进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳，回收得到1511bp的pcr产物，即得所述的ppgs1.1基因启动子。
具体实施方式十：本实施方式与具体方式九不同的是：所述的pcr扩增体系如下：
其他与具体实施方式九相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
表2启动子序列引物设计
取草地早熟禾基因组dna作为pcr模板，gennome walking kit试剂盒(takara，北京)中提供的简并引物ap1以及sp1作为引物，进行第1轮pcr。反应体系见表3。
表3pcr扩增反应体系
第1轮pcr反应条件如下：
取1μl第1轮产物作为模板，以ap1以及sp2作为引物，进行第2轮pcr反应。
表4 pcr扩增反应体系
第2轮pcr反应条件如下：
取1μl稀释100倍后的第2轮产物作为模板，以ap1以及sp3作为引物，进行第3轮pcr反应。反应体系见表5。
表5 pcr扩增反应体系
第3轮pcr反应条件与第2轮反应条件一致。
取第1、2、3轮产物各5μl进行电泳，对明亮的电泳条带进行胶回收，以sp3为引物对pcr产物进行dna测序。
根据测序结果设计特异性引物sp4。取1μl稀释100倍后的第3轮产物作为模板，以ap1以及sp 4作为引物，进行第4轮pcr反应。反应体系见表6。
表6 pcr扩增反应体系
第4轮pcr反应条件与第2轮反应条件一致。
取第4轮pcr产物5μl进行电泳，对明亮的电泳条带进行胶回收，以sp4为引物对pcr产物进行dna测序。
综合两次pcr反应测序结果，运用primerpreimer5.0设计ppgs1.1基因启动子序列的特异性引物，通过在线分析网站nebcutter2.0选取合适的酶切位点并添加到引物上。进行第5轮pcr反应。特异性引物见表7(下划线部分为酶切位点)。
表7启动子序列引物设计
表8 pcr扩增反应体系
第5轮pcr反应条件如下：
取第5轮pcr产物5μl进行电泳。将1.5kb左右的明亮条带切下，进行胶回收并以f1和r1为引物测序。
利用plantcare及place等软件进行启动子元件预测及分析。
2.5重组载体转化大肠杆菌
将2.3.6部分的第5轮pcr反应获得的片段连接trans-t1载体上。具体操作如下：
(1)连接反应体系见表9。
(2)将表9所述试剂混合，室温放置15min后将离心管放置于冰上备用；
(3)提前制备转化平板。把25μlkan(50mg/ml)加入25ml 50℃左右已完全融化的lb固体培养基中，轻摇混匀，在冷却前倒入培养皿(φ＝9cm)中，室温放置1～3h备用(在提前灭菌的超净工作台进行)；
(4)将反应液加到含有100μl dh5α的离心管中，冰浴30min；
(6)向产物中加入1ml常温的lb液体培养基(在提前灭菌的超净工作台进行)，200rpm，37℃震荡培养1h；
(7)将产物200rpm离心2min后分别吸取100μl上清和沉淀产物加到已制备的lb固体培养基上(含kan)，并用灭菌的涂布棒缓慢的将产物涂抹匀。封口膜封好后标记上对应的序号和日期，正向放置0.5h后倒置平板37℃过夜培养(在提前灭菌的超净工作台进行)。
筛选阳性克隆并进行测序。分别用枪头沾取3个白色单菌落，稀释到50μl无菌水中，标好序号，分别取1μl稀释液用做菌落pcr的模板，菌落pcr的体系和条件除用稀释液替换基因组dna外，其余条件皆与第5轮pcr条件一致。取5μl菌落pcr产物进行电泳检测，将有目的条带的对应稀释液加到lb液体培养基中(含kan)，37℃，200rpm培养过夜，将出现浑浊的菌液做好对应的标记后送往公司测序。将测序正确的菌液用试剂盒(trans，北京)提取质
根据草地早熟禾ppgs1.1基因启动子序列及表达载体pbi121质粒图谱上多克隆位点特点，引入hindⅲ和smaⅰ酶切位点，将表达载体和克隆载体双酶切。
，最后进行电泳并分别回收目的条带。
将得到的ppgs1.1启动子产物和pbi121-35s线性片段进行连接。
将表11所述试剂混合后25℃反应2h。将反应后的表达载体pbi121转化到大肠杆菌中筛选培养，得到将ppgs1.1启动子替换35s启动子的双元表达载体，命名为ppgs1.1-gus。将产物加入100μl大肠杆菌感受态，后续步骤接2.5(4)。
(4)将产物200rpm离心1min，分别吸取100μl上清和沉淀产物加到lb固体培养基上(含kan)，并用灭菌的涂布棒缓慢的将产物涂抹匀。封口膜封好后标记上对应的序号和日期，正向放置0.5h后倒置平板37℃培养2d(提前灭菌的超净工作台进行)。
(1)将含有ppgs1.1-gus表达载体的农杆菌菌株用枪头在提前制备好的lb(含相应抗体)固体培养基上划线，封口膜封好后标记上对应的序号和日期，28℃培养2d(划线与挑菌在提前灭菌的超净工作台进行)；
(3)将产物加到25ml lb液体培养基中(含相应抗生素)，28℃，200rpm震荡培养8h。此时，od600的值大致在1.0左右；
(4)将所得溶液转移到离心管中(如菌液过多可分多次加入)，5000rpm离心5min，弃上清后加入适量10mm mgcl2+10μm as+10mm mes重悬液，用枪头悬浮管底沉淀，此时od 600在0.8左右；
(5)用注射器将浸染液注射入烟草健康的叶片下表皮内(不能使用子叶)，处理2d；
(6)将注射处理和未被处理的烟草叶片放入gus染色液中，(染色液配制见表12)抽取植物组织表面的气体，使染色液充分浸入，37℃过夜；
(7)脱色：吸去染色液，用去离子水洗一次，加入无水乙醇脱色5～6h，至阴性对照为白色，吸去无水乙醇，最后加入去离子水完全浸没烟草叶片，常温保存。过程中需轻缓以防止叶片破碎。
表12 gus染色液的配制
2.8花序浸染法转化拟南芥
2.8.1拟南芥消毒与种植
(1)将少量拟南芥种子置于ep管中，无菌水洗3次；
(3)无菌水洗3次，加入10％的次氯酸钠1ml涡旋震荡30sec；
(5)将种子均匀播于ms固体培养基上(不含抗生素)，再吸去多余的水分，封口膜封好后标记上对应的序号和日期；
(6)4℃春化2d后移入组培室培养；
(7)7d后取绿色幼苗移至培养土栽培。
(1)取含ppgs1.1-gus表达载体的农杆菌菌液加入到25ml lb液体培养基中(含相应抗生素)，28℃，200rpm震荡培养24h左右。见菌液浑浊后5000rpm离心15min，弃上清后加入适量侵染液(5％蔗糖，0.05％sliwet-77，1/2ms液体培养基)将od值稀释至0.8；
(2)将刚出现少量角果的拟南芥植株提前一天将水浇透，剪除角果和已经开放的花朵；
(3)将花序倒插进转化液中10min；
(4)用黑色塑料袋将植株及花盆包好，侧放培养24h后去袋正常培养。当角果变黄时用纸袋将植株花序套住并用订书机固定住，待角果彻底成熟后收集种子，清除杂质，室温干燥10d后放到4℃的冰箱中保存备用。取一部分收获的种子消毒播种于相应抗生素筛选的1/2ms固体培养基上(种子消毒方法见2.8.1)。封口膜封好后标记上对应的序号和日期，4℃春化2d。取出培养皿放置于培养室中正常培养，10d后，挑选出长有绿色真叶和长出子叶的幼苗移栽至营养土培养室中正常培养；
(5)拟南芥转基因苗移栽一个月后，选取成熟健康的叶片提取总dna。以f1和r1为上下游引物对ppgs1.1基因启动子进行pcr检测，确定ppgs1.1基因启动子是否转入拟南芥植株中。
2.9转基因拟南芥gus基因表达检测
参照jefferson的方法进行，其反应原理为gus催化4-mug水解出4-mu，4-mu分子中的羟基解离后生成的产物可由荧光分光光度计定量其荧光值。
取不同逆境处理后的植物材料于液氮中充分研磨成粉末后装入提前灭菌的ep管中，取适量粉末加入3倍体积的gus提取缓冲液并充分混匀，gus蛋白提取液配制见表13，尽量使每个样品所取粉末的量保持一致，方便后续试验。4℃下10000rpm离心10min后吸取上清，获得总蛋白的粗提液。短期置于4℃保存，如需长期保存则置于-80℃冰箱。
将4-mu母液用0.2m na2co3稀释成2～100nm的梯度液，用于制作标准曲线。激发波长365nm及发射波长455nm测定不同浓度4-mu溶液的荧光值。以4-mu的不同浓度作为横坐标，不同浓度4-mu溶液所测得的荧光值为纵坐标，绘制4-mu标准曲线。
用0.9％的生理盐水稀释bsa(2mg/ml)溶液，配制成2～20μg/ml的梯度液，用于制作标准曲线。再将已经稀释好的不同浓度bsa溶液和待测蛋白样品及空白对照(gus蛋白提取液)各5μl分别加入到96孔板微孔中(每个浓度测定3次重复)，再加入200μl考马斯亮蓝g-250溶液。室温放置10min后用酶标仪测定595nm处的吸光度值。以不同浓度bsa溶液595nm处的测定结果作为纵坐标，bsa溶液浓度作为横坐标绘制bsa标准曲线。根据各个样品595nm处的测定结果，带入bsa标准曲线公式计算得出样品的蛋白浓度。
将20μl待测蛋白样品分别加入到96孔板微孔中(每个浓度测定3次重复)，每个孔中再加入1ml含有1mm4-mug的gus缓冲提取液中(37℃预热)，之后立即吸取200μl加入到800μl 0.2m na2co3于样品中混合终止反应(空白对照)，37℃温育。在10、30和60min后各取出200μl加入800μl 0.2m na2co3于样品中混合终止反应。测定各个样品经过不同反应时长后的荧光值后据此绘制标准曲线，再根据公式算出各个样品蛋白酶活性。gus基因表达活性以每mg蛋白每min生成1μm或1nm 4-mu的酶量来表示，单位是4-mu pmol/min/mg protein或4-mu nmol/min/mg protein。
(1)将转基因种子消毒后播种于相应抗生素筛选的1/2ms固体培养基上(方法见2.8.1)。封口膜封好后标记上对应的序号和日期，4℃春化2d。取出培养皿放置于培养室中正常培养，
(2)取培养6d的转基因拟南芥幼苗浸入gus染色液中染色(gus染色具体方法见2.7)；
(3)脱色后用显微镜观察并拍照。
2.10转基因拟南芥逆境处理
为了研究ppgs1.1启动子在氮素胁迫条件下的启动活性，将转基因拟南芥种子消毒后播种于1/2ms固体培养基上(含kan)。封口膜封好后标记上对应的序号和日期，4℃春化2d后正常培养，13d后将幼苗移到含有不同氮素浓度的1/2ms固体培养基上(不含抗生素)，对其分别进行硝态氮和铵态氮胁迫处理。处理及取样时间见表14。处理后采集植株，锡纸包好并标号，液氮速冻后置于-80℃保存，用作ppgs1.1启动子的逆境活性分析。
3.1草地早熟禾总dna的提取
草地早熟禾基因组dna电泳结果如图1所示，条带清晰且无明显的弥散和拖尾，说明其质量较好。紫外分光光度计上检测其吸光度od260：od280比值皆在1.8左右，说明其质量较为纯净，能满足后续试验的基本要求。其浓度皆在100～200ng/μl之间，统一稀释至100ng/μl后标号并记录日期，放置于-20℃冰箱备用。
3.2启动子的克隆与序列分析
3.2.1启动子序列克隆
本试验以sp1、sp2、sp3为下游引物，以gennome walking kit试剂盒(takara，北京)中提供的简并引物ap1为上游引物，以草地早熟禾基因组dna为模板，共进行3轮pcr，最终获得一段ppgs1.1基因启动子序列。再根据这段序列设计引物sp4，进行第4轮pcr，胶回收目的条带并将其连接到t载体上后进行测序。最终获得ppgs1.1基因启动子片段(如图2所示)。
3.2.2酶切位点选择
将通过染色体步移技术获得的ppgs1.1基因启动子序列放入nebcutter2.0网站上进行酶切位点分析(如图3)，再综合pbi121表达载体上camv35s启动子两端的多克隆位点，最后选取hindⅲ(aagctt)作为上游酶切位点，smaⅰ(cccggg)作为下游酶切位点。用作目的片段与表达载体的连接。
3.2.3启动子全长扩增
根据第4轮pcr获得序列的测序结果，通过primer preimer5.0软件设计特异性引物(f1，r1)，并在上下游引物两头分别接上对应的酶切位点。以草地早熟禾基因组dna为模板进行常规pcr扩增。最终获得大小为1511bp的ppgs1.1启动子序列(如图4所示)。
将含有ppgs1.1基因启动子的克隆载体和表达载体pbi121分别用hindⅲ和smaⅰ双酶切(图5)，再将获得的两条目的片段进行t4连接，使ppgs1.1基因启动子替代表达载体自身的camv35s启动子(图6)。最终获得ppgs1.1基因启动子与gus基因融合的植物表达载体，命名为ppgs1.1-gus。
为确定草地早熟禾ppgs1.1基因启动子能否驱动gus基因表达，利用由农杆菌介导的烟草瞬时转化系统，用注射器将包含ppgs1.1-gus表达载体的浸染液注射入烟草健康的叶片下表皮内，培养2d后进行组织化学染色，拍照并保存。结果如图所示(图7)，ppgs1.1基因启动子融合载体浸染后的叶片表现出明显的蓝色斑点(图中画圈部分及箭头指示部分)，说明ppgs1.1基因启动子在烟草叶片中拥有转录活性。
3.5转基因植株的获得与验证
3.5.1转基因植株的获得
为探究草地早熟禾ppgs1.1基因启动子在转基因植物体内的转录活性，将包含ppgs1.1-gus的表达载体转化拟南芥。对收获的部分种子进行筛选，初步得到抗性植株(图8)。
3.5.2转基因植株的验证
用转基因苗dna为模板获得了1809bp的gus基因序列而野生型dna没有获得条带说明含ppgs1.1-gus的植物表达载体转化成功(图9a)。用转基因苗dna为模板获得了1511bp的ppgs1.1基因启动子序列而野生型dna没有获得条带，进一步说明含ppgs1.1-gus的植物表达载体转化成功(图9b)。初步验证了转基因拟南芥植株。
3.6ppgs1.1基因启动子组织表达分析
gus组织化学染色结果如图10所示，gus在茎中表达明显(图10a)；在根中表达不均匀，根尖分生区表达显著(图10b)；在相对成熟叶片中表达明显，但在幼嫩的子叶中表达不明显(图10c)。说明草地早熟禾ppgs1.1基因启动子在拟南芥全株中都具有转录活性，且有着不同的时空特性。
3.7.1蛋白标准曲线的制作
蛋白标准曲线如图11所示。在2～20μg/ml的内线性关系良好(r 2＝0.9925)。方程式为y＝0.4。根据测定样品的吸光值，带入方程式从而计算出样品的蛋白浓度。
3.7.2荧光标准曲线的制作
荧光标准曲线如图12所示。在2～100nm的内线性关系良好(r2＝0.9993)。方程式为y＝0.。根据测定样品的荧光值，带入方程式从而计算出样品的gus表达量。
3.7.3氮素处理对启动子活性的影响
根据对草地早熟禾ppgs1.1启动子中顺式元件的预测结果，为验证该启动子是否对外源氮素产生响应，将转基因拟南芥t 3代种子消毒后播种于1/2ms固体培养基上(含kan)，13d后(图13)将幼苗移到分别含有0mm、1.5mm、15mm、30mm硝态氮和铵态氮的1/2ms固体培养基中(不含抗生素)，温室培养2d后检测gus酶活性。结果表明：gus活性随着氮素浓度的升高而增强。含15mm硝态氮的ppgs1.1启动子的gus活性比对照高1.48倍，含30mm硝态氮的活性则比对照高1.85倍(图14a)。对于1.5mm铵态氮，ppgs1.1启动子的gus活性比对照高1.84倍，对于30mm铵态氮则高4.18倍(图14b)。综上所述，铵态氮对ppgs1.1启动子的活性影响更大。这些结果证明氮素能诱导ppgs1.1启动子的活性。