近年来,儿童患龋明显呈上升态势,第四次全国口腔流行病学调查显示,全国3岁儿童的龋患率为50.8%,4岁儿童为63.6%,到了5岁则高达71.9%[1]。通过龋病风险预测,早期发现并采取预防措施是控制龋病的关键[2]。

CAT)是早期检测龋病风险的实验室方法,目前应用较多的方法有检测变形链球菌数量、观察乳杆菌数量、观察菌群分解蔗糖程度、测试唾液缓冲能力等[3]。其中Cariostat龋活跃性试验法是通过培养细菌,观察培养基颜色变化从而判定致龋菌群生长及分解蔗糖的程度,预测机体对龋病的易感性。该方法对儿童群体操作相对简单,无特殊实验室要求,结果判定容易,成为应用于儿童龋易感性筛查中较为常用的判定龋活性的方法[4]。然而,由于进口龋活性检测产品成本较高且获得渠道有限,寻找简便易得的试剂盒,评估儿童患龋风险具有重要意义。

基于此,本研究的目的是通过比较一种国产培养基和日本标准培养基两种龋活性测试剂在检测细菌产酸方面的一致性、敏感性和准确性,借此评估国产龋活性培养基的有效性。

Ltd,Liverpool,英国);胰蛋白胨大豆琼脂(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司,青岛,中国);革兰染色试剂(珠海贝索生物技术有限公司,珠海,中国);氯化钠粉剂(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司,青岛,中国);0.9%氯化钠(国药集团化学试剂有限公司,上海,中国);所采用的测试菌种为:变异链球菌UA159(Streptococcus

上述8种细菌,接种于琼脂/血培养基,37℃厌氧复苏48 h,收集菌落做生化鉴定,确定为纯培养后分别由脑心浸液(Brian-heart-infusion, BHI)中培养24～48 h增菌,革兰染色后显微镜下观察并摄片,确保菌株无污染后,离心收集细菌后由0.9%生理盐水冲洗2次,将上述菌种分别置于紫外分光光度计540 nm处制备成紫外分光吸光度值在1.0±0.2的菌悬液。图1示显微镜下的8种菌株。

菌悬液梯度稀释,用0.9%生理盐水(0.9%NS)将菌悬液按照不同比例进行稀释为4组:未稀释、1∶10、1∶100、1∶500。各浓度梯度的菌种重复4次。并设置0.9%生理盐水为空白对照组。

将上述稀释梯度及空白对照分别取100μL加入至国产培养基及标准培养基中。37℃恒温培养48 h。依据产品说明书,在同一光源条件下,3名经过培训并且一致性良好的读数员采用盲法读数,即由试验者打乱培养基顺序后读数。

图1本实验采用的测试菌种

使用SPSS 19.0统计软件包进行国产与标准培养基读数的卡方检验(计算Kappa值),并计算准确率、敏感性、特异性,统计中显著性检验水平设为0.05。

本次国产培养基与标准培养基读数结果见表1。按照患龋的低风险和中高风险分别记为0和1,对读数重新编码,检查者1、2、3的Kappa值分别为0.803、0.785和0.832(P

表1检查者原始读数汇总

表2各检查者龋风险读数(重编码)

表3检查者龋风险读数汇总(重编码)

龋病是一种在多因素影响下,以细菌为主的牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病[5]。儿童龋病发病率高居儿童常发疾病的首位,根据我国第四次全国口腔健康流行病学调查报道显示,全国3～5岁年龄组乳牙患龋率为62.5%[1],对儿童龋齿的预防显得尤为重要。

菌斑既是龋病的病因,又是龋病发生的环境,其产酸能力大小是判断牙菌斑致龋力的重要指标之一,牙菌斑内的产酸代谢活动是产生龋病损害的直接原因[1,2,5]。

如今,致龋微生物作为龋发生的预测指标已经得到了认可,在致龋微生物中,变形链球菌和乳杆菌与龋病发生和进展的关系已非常明确[6]。对早期釉质龋的研究发现,龋活跃人群的牙菌斑中变形链球菌、乳杆菌等产酸、耐酸力强的细菌含量较不活跃人群明显增高,其中变形链球菌的水平可以作为低龄儿童龋的预测指标[7,8]。通过多项对低龄儿童患龋的细菌学研究表明,患龋儿童菌斑中变形链球菌的检出率及变形链球菌占总链球菌的百分比均明显高于无龋儿童[9]。Cariostat是通过检测菌斑产酸能力来评估龋易感性的方法之一,菌斑中产酸致龋菌在试剂培养基内经恒温培养分解代谢蔗糖生成乳酸,使试剂中特定的pH指示剂产生显色反应,显色变化能反映乳酸的生成量,由此推断采样标本中致龋菌的量及机体的龋病活跃性[4,5,10]。有研究显示Cariostat值在婴儿期已显示出和低龄儿童龋的显著相关性,对低龄儿童龋的发展起到早期预测作用[11,12]。以Cariostat为代表的龋易感性检测操作简便,结果准确且可多次重复,适宜应用于预测儿童患龋风险[13,14]。但由于进口检测试剂的渠道和价格的限制,在临床持续应用及群体筛查工作中并未普及。本次实验选择的国产培养基取样方法亦简便无损伤,与标准培养基的产品主要组成成分相似,均由胰蛋白胨、蔗糖、氯化钠、溴甲酚等组成,所培养的细菌以胰蛋白为氮源、以蔗糖为碳源、以溴甲酚为酸性显示剂,培养时产酸从而改变培养基的颜色[15,16]。

本实验选择的8种标准菌是口腔内的主要致病菌,除了常见的产酸、耐酸菌株如变形链球菌和嗜酸乳杆菌外,本次实验也选用了具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌等牙周致病菌。选择此类非产酸耐酸菌作为阴性对照,以验证国产培养基对于其他非酸性产物无阳性反应。但本实验只选用了8种标准菌株,而非混合菌斑,不能代表人体内菌斑的实际情况。今后应进一步检测两种培养基在检测体内混合菌斑方面的一致性,以提供更多数据。

针对两种培养基的实验读数,3名检查者所得到的Kappa值介于0.78～0.83,总Kappa值为0.8以上,证明国产培养基对于判断龋低危和中高危方面,是完全可靠的。但两种培养基还存在一定差异,推测可能的原因是:国产培养基与标准培养基组分近似,但各成分浓度的细微差异使得两种培养基培养出的致龋菌浓度仍存在一定差异。就本次实验结果看,国产培养基敏感性高于标准培养基,即国产培养基诊断得分普遍高于标准培养基,可以更敏感地识别有龋易感性的儿童,但相较于敏感度,其特异性尚显不足。今后仍需结合其他检测方法,用于大规模人口的筛查。

目前,龋活性实验主要用于流行病学调查中目标人群的筛查,要求所采用的试验方法简单、成本低廉。然而目前常用的进口龋活性检测产品成本较高,并且产品获得渠道受限,限制了国内相关研究的开展。此次实验旨在通过实验室的前期研究,检验国产培养基在检测细菌产酸方面的效果,为进一步推广使用国产培养基提供实验室的依据和数据。本次实验选择的国产培养基可能是一种非常有希望的替代品,但其是否能够准确预测龋易感性仍需进一步的针对人群的前瞻性研究。同时,科学准确评估患龋风险是儿童龋病预防中的重要一环。龋病为多因素致病疾病,国际常用龋风险评估体系都是多因素综合的系统,包括美国儿童牙科学会(AAPD)研发的Caries-riskAssessmentTool,美国加尼福利亚牙科协会研发的CariesManagementbyRiskAssessment;美国牙科协会(ADA)研发的Caries-riskAssessmentSystem;瑞典研发的cariogram等[17,18,19,20]。但上述龋风险评估体系不适用于国人,且单一预测方法尚无法准确预测龋病易感性,因此后续研究包括:继续寻求更多高准确度、高性价比、易获取的实验产品(如唾液流速相关产品、唾液缓冲能力检测产品等);建立健全适用于我国儿童的,综合临床检查、病史、口腔细菌环境等多因素的龋病风险评估系统,更好地为我国人群的龋病预防服务。

[4]石四箴,药师寺仁,町田幸雄.龋病活跃性试验的应用研究[J].国外医学口腔医学分册,4-207.

[8]袁峻伟,玄松玉,王珏,等.北京市海淀区3岁儿童龋病患病状况及龋病活跃性检测的研究[J].北京口腔医学,):166-168.

[13]许世梃,石四箴,梁勤.两种龋病活跃性检测法的比较研究[J].上海医学,):663-666.

[15]梁勤,石四箴.检测幼儿龋病活跃性的研究[J].同济大学学报(医学版),):105-109.

VIVIEN FENG,张羽,曹桂芝,吴日玥,陈曦.一种国产龋活性培养基与标准培养基一致性及有效性的实验检测[J].口腔医学,):602-605.

基金:国家自然科学基金();上海市卫健委适宜技术项目()

第一、芽孢杆菌属的分类

一、芽孢杆菌属微生物特性

芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧，产生芽孢，大多数无荚膜，以周生鞭毛运动。细胞呈直杆状，常以成对或链状排列，具圆端或方端。由于芽孢杆菌属的微生物能够形成芽孢的特性使得他们能够抵抗各种极端环境如高温、极酸、极盐，而且对各种杀菌剂具有抵抗力，因此，他们在各种自然环境中都能被分离到。芽孢杆菌属微生物具有共同的特性，都能够形成带有芽孢的生物膜，且代谢产物相似，都能产生环肽、抗生素、酸（多聚谷氨酸、聚天冬氨酸）和聚多糖等。

二、芽孢杆菌的分类方法

分类学是研究生物分类的原理、方法和实践的科学，包括分类、命名、描述和鉴定等内容。目前细菌分类主要是采取多项分类技术。多项分类的概念是Colwell于1968年提出的，原理是利用微生物多种不同的信息，包括表型、基因型和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。概括的讲，多项分类是传统的表型分类、数值分类和分子分类等方法的综合应用，因而可以更客观地反映生物间的系统进化关系。目前，多项分类法被认为是研究各级分类最有效的手段，可用于所有水平上分类单位的描述和定义。

2、1经典分类（表型特征）

表型是由于基因和环境因素相互作用引起的，在细胞、器官和整体水平上能检测和观察到的特征。一般，原核生物的表型特征能区分不同菌种但不能区分菌株。表型特征包括形态学特征、生理生化特征、抗生素的敏感性、噬菌体分型、血清学分析。表型特征虽然不能说明物种之间的亲缘关系，但它却是人们认识微生物实际重要性和研究生物进化的基础，仍然是分类研究的基础。

芽孢杆菌，菌体杆状，直或近直，0.3~2.2×2.1~7.0um,多数运动，鞭毛典型侧生，形成抗热内生孢子，严格好氧或兼性厌氧。由于实验条件的限制，传统芽孢杆菌的分类主要是根据形态学特征即好氧或厌氧和有无芽孢形成。Gibson和Gorden依据芽孢的形状（卵形或球形）以及它们在菌体或芽孢囊中的位置，提出芽孢形态群体概念，将芽孢杆菌分为三个类群。由于这个种的分离方法是以群体来划分的，它对芽孢杆菌分类鉴定有着非常重要的作用。

群1、孢囊不显著膨大，芽孢椭圆或柱形，中生到端生，革兰氏阳性

A、生长在葡萄糖洋菜上的淡染细胞的原生质中有不着色的球状体

B、生长在葡萄糖洋菜上的淡染细胞的原生质中没有不着色的球状体

群2、椭圆形芽孢使孢囊膨大，芽孢中生到端生，革兰氏阳性、阴性或可变

B、不从碳水化合物产气

群3、包囊膨大；芽孢通常球形，端生到亚端生；革兰氏阳性、阴性或可变

《伯杰氏系统细菌学手册》指出：（1）DNA-DNA同源性在60%以上通常认为是同一种；（2）同源性在20-60%之间认为是同一属中的不同菌种；（3）同源性在20%以下的应考虑是不同属的菌种。随着技术的发展，芽孢杆菌的分类逐渐由传统的表型分类转化为分子分类，如G+C

mol%分析：DNA含有A、G、C、T四种碱基，一般生物个体的DNA分子中（G+C）/(A+T)的比例是非常稳定的。G+C mol%的测定常用于验证已建立的分类关系是否正确，是细菌分类鉴定的基本方法，并作为描述细菌分类单位的特征之一。测定方法有熔点法（Tm值法）、浮力密度法、高效液相色谱法等。通常认为，种内菌株间G+C mol%相差不超过4%，属内菌株间的差异不超过10%。对芽孢杆菌的G+C mol%变化大约在33~65%,说明种还可以划分为几个遗传同源性的种类。

DNA-DNA杂交；DNA同源性分析是确定正确的分类单位，建立自然分类系统的最直接方法，而DNA-DNA杂交是分析DNA同源性的一种有效手段。利用DNA杂交可以在总体水平上研究菌株之间的关系，用于种水平上的分类研究。1987年国际系统细菌委员会规定：DNA同源性≥60%为细菌种的界限，DNA同源性≥70%是同一亚种，同源性在20~60%之间为同属不同种。在细菌分类中DNA杂交已被确定为建立新种的必要标准之一。常用的方法有液相复性速率、固相膜杂交法、羟基磷灰石吸附法、S1核酸酶法等。

由于16S rDNA基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具。Masataka Satomi等从宇宙飞船设备上得到一些分离物，经试验分离证明是一种细菌，16S rRNA序列系统发育分析表明是属于芽孢杆菌属，与Bacillus pumilus(短小芽孢杆菌)很相近但又有很多表型不同的地方，DNA-DNA、rep-PCR表明是芽孢杆菌的一个新种，命名为Bacillus pallidus与芽孢杆菌属有很大的区别而和Geobacillus很相近，故将它归入Geobacillus属。所以利用分子技术可以根据菌的基因进行鉴定，提高芽孢杆菌的分类地位划分的更准确。微生物的分类地位进行初步判断流程如下：

与Genbank中已知序列进行Blast比对 → 找出相似性最高的序列 → 将所得序列排序比 → 用建树软件建树状图 → 判定目的菌的分类地位或系统发育地位

以微生物化学组成成分为指标进行微生物分类研究的学科称为微生物的化学分类学。化学分类技术是检验微生物的某些化学成分而不是其生物学特征，微生物中含有一些化学物质，其含量或结构具有种属特征或与其分类地位密切相关，能够标志某一类或某几种微生物的存在，称为生物标志物。这些具有分类学意义的化学物质的存在状态可以作为鉴定微生物的标志。很多仪器分析手段如高效液相色谱、气相色谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用等，逐渐在微生物分类和鉴定中显示出强大的功能。

细菌细胞内的脂肪酸易于提取和分离，经过甲酯化后挥发性大大改善，稳定性好，很适合于气相色谱分析。在细菌分类学中，气相色谱是分析细菌脂肪酸成分的主要工具。脂肪酸是细菌细胞中一种含量较高的、相对较稳定的化学组分，只要存在于细胞膜等生物膜脂双分子层以及游离的糖脂、磷脂、脂蛋白等生物大分子中。已有的研究结果表明，各种细菌中存在300多种脂肪酸及脂肪酸衍生物。种类不同的细菌含有的脂肪酸的种类和含量有一定的差别，人们可以根据脂肪酸的不同含量对未知菌株进行鉴定命名。脂肪酸对于不同生物油不同的成分特征，是细菌分类的重要指标和依据。目前，脂肪酸成分分析已成为芽孢杆菌分类鉴定的一种新手段，通过脂肪酸成分分析可以将未知菌快速鉴定到种属。宋亚军等人对若干需氧芽胞杆菌的芽孢脂肪酸成分进行了系统分析，并探讨了其在分类学上的意义，为需氧芽胞杆菌的分类研究提供了新的资料。

醌组分分析   细菌细胞膜上的醌有泛醌（辅酶Q）和甲基萘醌（MK）。甲基萘醌的侧链由不同的异戊烯单位构成，根据侧链长度和双键氢化的程度可分为多种类型。不同类型由甲基萘醌的有无与含量是属和种鉴定中的一个重要指标。

磷酸类脂分析   磷酸类脂是一种极性脂类，是构成细胞膜的重要成分。研究表明具有分类学意义的磷酸类脂为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰甲基乙醇胺、磷脂酰甘油、含葡萄糖未知结构的磷酸类脂等。

全细胞蛋白SDS-PAGE是一种通过分析蛋白电泳图谱来获取分类信息的技术。在高度标准化的培养条件下它是一种分群和大量比较相近菌株的较好方法。该方法的一个优点是它与DNA杂交分析结果有很好的相关性，适用与种的水平上的区别。

第二、芽孢杆菌的分离、保存与鉴定

一、微生物分类鉴定主要是采用多相分类法，综合表型特征、化学特征、分子测序等方法。本次运用生理生化特征、脂肪酸鉴定等方法对分离的芽孢杆菌菌株进行鉴定，并对脂肪酸鉴定和ITS测序两种鉴定方法进行了比较。

2、1芽孢杆菌的分离方法

采用稀释涂布法从土壤中分离芽孢杆菌，实验方法操作参照钱存柔、黄仪秀编著的《微生物学实验教程》。具体方法如下：

①称样   称取10g土壤至装有90mL无菌水的三角瓶，振荡15min，使之充分溶解，即配成10^（-1）浓度；②稀释 吸取1mL原液至装有9mL无菌水的试管，即配成10^（-2）浓度，再次稀释成10^（-3）；③水浴   将稀释好的土样溶液放在80℃水浴锅水浴10min，期间振荡2-3次；④涂布   超净台上无菌操作，溶液在振荡器上振荡10-20s，吸取100uL至相应标记浓度的平板上，溶液滴至平板中央，涂布棒涂匀。每个梯度重复3次；⑤培养   将涂好的平板用倒置于30℃恒温箱中培养1-2d；⑥划线分离 选取要纯化分离的芽孢杆菌菌株并编号，纯化后30℃培养箱中培养；⑦结果计算   每克土样中芽孢杆菌的数量=同一稀释度的3个平板上菌落平均数×稀释倍数/含菌样品克数。

2、2 芽孢杆菌的保存

采用甘油冷冻保存和穿刺保存法，甘油冷冻保存菌株放于-80℃超低温冰箱，穿刺保存放于室温。

2、3 芽孢杆菌的鉴定

2、3、1芽孢杆菌的生理生化鉴定

    试验方法是参照东秀珠等编的《常见细菌系统鉴定手册》。

生理特性   ①温度梯度培养 测定温度（℃）有5,10,15,30,37,50,55，采用连续划线法取幼龄菌种划线培养，设3个重复，2d后观察结果。pH梯度有4.5， 9.5，取幼龄菌种划线接种，设3个重复，2d后观察结果。耐盐NA培养基中加入不同浓度的NaCl（2%、5%、7%、10%），取幼龄菌种接种培养，设3个重复，培养3和7d，目测生长情况。②丙二酸利用 7.0-7.4，分装试管，121℃灭菌15min,同时有不加丙二酸的空白对照。用幼龄菌接种，设3个重复，适温培养1-2d，培养基由绿变蓝者为阳性；培养基不变色者为阴性。③柠檬酸盐利用 0.5g，柠檬酸钠2g，0.04%酚红液20mL，蒸馏水1000mL，pH7.0分装试管，121℃高压灭菌15min。斜面上划线接种，适温培养3-7d，培养基为碱性（指示剂蓝色或桃红色）者为阳性，否则为阴性。

生化特性   ①接触酶 将24h培养的菌种，以铂丝接种环取一小环涂抹于已滴有5%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生为阳性，否则为阴性。②氧化酶 在干净培养皿里放一张滤纸，滴上四甲基对苯二胺的1%溶液，刮取菌苔涂抹在滤纸上，菌苔10s蓝色为阳性，10-60s变蓝为延迟反应，60s后为阴性反应。

0.2g，葡萄糖10.0g，琼脂6.0g，溴百里酚蓝1%水溶液3mL，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2,121℃蒸汽灭菌20min。以18-24h幼龄菌种做种子，穿刺接种，每株4支。其中两支用灭菌的凡士林石蜡油（熔化的2/3凡士林中加入1/3液体石蜡，高压灭菌）封盖，约0.5-1cm厚，以隔绝空气为闭管。另2支不封油为开管，同时还要有不接种的闭管和开管作对照。适温培养1，2，7，14d观察结果。只有开管产酸变黄者为氧化型；开管和闭管均产酸变黄者为发酵型。

5g，蒸馏水1000mL，pH7.2），0.2%可溶性淀粉，取新鲜培养物点中于在肉汁胨中加入0.2%可溶性淀粉平板，适温培养。培养2-5d后观察形成明显菌落后，在平板上滴加碘液平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色的透明圈，表示淀粉水解阳性，仍是蓝黑色为阴性。

5g，水1000mL，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。试剂为甲基红（甲基红0.1g，95%乙醇300mL，蒸馏水200mL）。接种实验菌于上述培养基中，每次3个重复，置适温培养2d，6d观察结果。在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红阳性反应，黄色为阴性反应。（甲基红变色范围是4.4红至6.0黄）。

40%。接种实验菌于上述培养液中，每次3个重复，置适温培养2d，6d观察结果。取培养液和40%氢氧化钠等量混合，加少许肌酸，10min后培养液若出现红色，即为阳性反应，否则为阴性。有时需要放置更长时间才出现红色反应。

硝酸还原反应   培养基为肉汁胨培养基牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL，KNO3 1g，pH 0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸（10%）150mL；二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。将测定菌接种于硝酸盐液体培养基中，置适温培养1，3，5d，每株菌作2个重复，另留两管不接种作对照。取两支干净的空试管或在比色瓷盘小窝中倒入少许培养1，3，5d的培养液，再各加一滴A液和B液，在对照管中加入同样A液及B液一滴；当培养液中滴入A、B液后，溶液如变粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加一、二滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原反应；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，按硝酸盐还原阳性处理。

培养基为1%胰胨水溶液；pH7.2-7.6，分装试管，121℃灭菌20min。试剂为对二甲基氨基苯甲醛8g，乙醇760mL，浓HCl 160mL。把新鲜的菌种接种于上述培养基中，适温培养。培养1，2，4，7d后，沿管壁缓缓加入3-5mm高的试剂于培养液表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可加入4-5滴乙醚至培养液，摇动，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮于液面后再加吲哚试剂。

培养基为蛋白胨5g，明胶100g，水1000mL，pH7.2-7.4，分装试管，121℃灭菌15min。取24h的培养菌穿刺接种，并有2支空白对照。30℃培养箱中培养2d后放在冰箱中，7，10，14，30d后观察是否液化。

2、3、2 芽孢杆菌的脂肪酸鉴定

脂肪酸提取方法主要是参照MIDI操作手册，具体如下：①获菌   挑取约40mg菌苔放入一个干净、干燥13mm×100mm有螺旋盖的试管中。②皂化   加入1.0±0.1mL的试剂1，拧紧盖子，振荡试管5-10s，沸水浴5min，取出振荡5-10s，拧紧盖子，继续水浴25min，试管移至室温冷却。③甲基化 加入2.0±0.1mL的试剂2，拧紧盖子振荡5-10s，精确控制（80±1）℃水浴10min，移开且快速用自来水冷却至室温。④萃取 加入1.25±0.1mL的试剂3，拧紧盖子，快速振荡10min，打开管盖，利用干净的移液管取出每个样本的下层似水部位。⑤基本洗涤 加入3.0±0.2mL的试剂4，拧紧盖子，快速振荡5min，取出约2/3体积的上层有机体到干净的GC小瓶。⑥上样，鉴定。

3、1芽孢杆菌的生理生化鉴定

细菌的生理生化性状具有可变性，使用不同的化学药品得出的鉴定结果可能会有一些的差异。所以很难用常规的生理生化指标将细菌鉴定到种。一般，生理生化指标只作为鉴定的辅助手段，描述微生物的一些基本特征。

3、2芽孢杆菌的脂肪酸鉴定

MIS是一套由美国MIDI公司开发成功的微生物鉴定自动化系统，该系统操作简单、安全、快速，实验成本也相对较低。它主要根据不同种类微生物细胞膜中磷脂脂肪酸的类型和含量具有种的特异性、指示性和遗传稳定性等特殊性能对微生物进行全自动鉴定和分析，该系统备有图谱识别软件和迄今为止微生物鉴定系统中最大的数据库资源，包括嗜氧菌1100余种，厌氧菌800余种，酵母菌和放线菌约300种，共计超过2200种。

刘志辉等应用气相色谱技术分析全细胞脂肪酸进行分枝杆菌菌种鉴定，和传统鉴定方法结果具有良好的一致性。脂肪酸的鉴定和16S rRNA 的序列相似性分析对微生物分类鉴定有着同等重要地位，每种菌特征脂肪酸的种类和含量不同，根据特征脂肪酸可以将未知菌快速鉴定到种或属。

三、芽孢杆菌鉴定方法的比较

     微生物种类繁多，以形态学和生理生化指标为基础的细菌鉴定较为复杂，而且是一项繁琐、费时的工作，对一种未知细菌的鉴定和分类，不仅需要分析多个生化指标，有时还要取决于工作人员的经验。近几年，随着核酸测序技术的普及和测序周期缩短、成本降低，细菌核酸序列数据库的不断充实，16S rDNA全序列和16S-23S rDNA间的内源转录间隔区序列测定已成为细菌的快速鉴定方法。但分子方法操作比较复杂，成本高且局限于典型性已鉴定的菌株。因此迫切需要建立一些简单、方便、易于操作的分类鉴定方法对微生物进行分析，使人们在一定程度上更科学、更精确、更快速地找到分离物的分类地位。

现代微生物学研究表明，细菌的细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌的DNA具有高度的同源性，不同种属的细菌脂肪酸的组成和含量表现出不同程度的差异，并且这种差异是比较稳定的，根据脂肪酸成分可以将未知菌株快速鉴定到种或属。

三、芽孢杆菌的生态分布及多样性

一、芽孢杆菌的形态特征

 芽孢杆菌的形态特征包括细胞形态和菌落形态特征。芽孢杆菌细胞为杆状，直或近直，长生芽孢。如图描述了3种芽孢杆菌的细胞形态，a-d为简单芽孢杆菌的细胞形态：a为没有形成芽孢时的细胞形态，b-d为产生芽孢后的形态，从图中可以看出简单芽孢杆菌的芽孢中生，柱形或椭圆形。图片e为类芽孢杆菌的细胞形态：细胞小，短杆状，芽孢中生，近卵圆形。f为枯草芽孢杆菌的细胞形态：细胞长杆状，芽孢中生，柱状。

芽孢杆菌菌落形态根据种不同而不同，以下描述了几种常见芽孢杆菌的菌落形态：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)白色或浊白色，扁平，干燥，无光泽，表面的层膜状物形成褶皱，有的菌落中间有“水珠”，还有一株芽孢杆菌的菌落形态和其他完全不同，浅黄色，突起，近圆形，光泽，湿润。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)黄色，湿润，光滑，不透明，粗壮，具有流动性，有的菌落表面微皱，菌落培养久时会产生黑色色素。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)白色，扁平，圆形，边缘不整齐，有的布满整个平板，和覃状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)的菌落相似。球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus)浅黄色，圆形，有光泽，不透明，有时连成一片布满整个平板。多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)菌落小，米粒状，粘，紧贴培养基，不易挑取。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)黄色，湿润，边缘不整齐，突起。

二、芽孢杆菌的生态分布

2、1我国芽孢杆菌的种群数量

从表9中可以看出，巨大芽孢杆菌和简单芽孢杆菌在每个样点都能分离到，除青海外，每个样点都能分离到蜡状芽孢杆菌。15个采样点分离出12个芽孢杆菌种群，每个样点之间芽孢杆菌种群数量差异很大。每个采样点数量最多的芽孢杆菌菌种群分别为：吉林采样点的是巨大芽孢杆菌干土，新疆的为蜡状芽孢杆菌干土，内蒙古的为蜡状芽孢杆菌，甘肃的为巨大芽孢杆菌干土，宁夏的为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）干土，青海的为巨大芽孢杆菌干土，西藏的为简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)干土，陕西的为简单芽孢杆菌干土，山东的为巨大芽孢杆菌干土，上海的为蜡状芽孢杆菌干土，江西的为蜡状芽孢杆菌干土，四川的为蜡状芽孢杆菌干土，广东的为短小芽孢杆菌干土，云南的为为蜡状芽孢杆菌干土，海南的为巨大芽孢杆菌干土。

根据优势种群的划分标准，某个物种占整体的百分比≥10%为优势种，1-10%之间为常见种，≤1为少见种。从表10可以看出，吉林采样点的优势种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌，常见种群为多粘类芽孢杆菌，少见种为蜡状芽孢杆菌和球形芽孢杆菌；新疆的优势种群为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌黑色变种(Bacillus atrophaeus)，常见种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，少见种为苏云金芽孢杆菌；

内蒙古优势种群为蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，常见种群为球形芽孢杆菌，少见种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种、多粘类芽孢杆菌；甘肃的优势种群为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种，常见种群为简单芽孢杆菌；青海的优势种群为巨大芽孢杆菌和简单芽孢杆菌；西藏的优势种群为简单芽孢杆菌，常见种群为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌；陕西的优势种群为简单芽孢杆菌，常见种群为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种，山东的优势种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌，常见种群为蜡状芽孢杆菌；上海的优势种群为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌；江西的优势种群为蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、短小芽孢杆菌；四川的优势种群为蜡状芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌；少见种群为巨大芽孢杆菌；广东的优势种群为蜡状芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，常见种群为巨大芽孢杆菌、球形芽孢杆菌；云南的优势种群为蜡状芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、球形芽孢杆菌，常见种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌；海南的优势种群为蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种。

2、1我国芽孢杆菌种群的多样性

从表11可以看出，15个分离到的采样点芽孢杆菌的丰富度在2-8之间。青海采样点的分离到的种群最少，只分离到2种，新疆、内蒙古和宁夏的芽孢杆菌丰富度最高，为8。陕西、四川和海南的丰富度为6，甘肃、江西、上海、广东、云南的物种丰富度为5，西藏的丰富度为3。15个采样点芽孢杆菌的多样性指数范围在0.6之间，西藏、内蒙古、陕西、青海、上海、四川芽孢杆菌的多样性指数在1.0000以下，其他采样点的多样性指数在1.0000以上，在1.6之间。新疆采样点的多样性指数最高，达1.5586，西藏采样点的多样性指数最低，仅为0.2657。均匀度指数在0.2之间，3个采样点的均匀度指数在0.0之间，4个采样点的均匀度指数在0.0之间，3个采样点在0.0之间，其中均匀度指数最高的是江西样点，最低的是西藏样点。生态优势度指数在0.9之间，最高的西藏样点，达0.8199，最低的是海南样点，只有0.2136。

从表11中可以看出，新疆样点的物种丰富度和多样性指数最高，其均匀度指数较高，生态优势度指数较低，西藏的物种丰富度较低，多样性指数和均匀度指数最低，生态优势度指数最高。生态优势度指数反映了各物种种群数量的变化情况，生态优势度指数越大，说明群落内物种数量分布越不均匀，优势种的地位越突出。说明物种多样性不仅与物种的丰富度有关，还可能与种群数量差异程度有一定的关系。

2、3芽孢杆菌的生态分布

巨大芽孢杆菌和简单芽孢杆菌在每个采集样点都能分离到，除青海外，每个样点也都能分离到蜡状芽孢杆菌。每个采集地的芽孢杆菌的多样性不一致，新疆样点的丰富度和多样性指数最高，生态优势度很低；西藏的物种丰富度较低，多样性指数最低，生态优势度指数最高。生态优势度指数反映了各物种种群数量的变化情况，生态优势度指数越大，说明群落内物种数量分布越不均匀，优势种的地位越突出。相同生境类型不同地理位置的生物多样性也不同。由此说明物种多样性不仅与物种的丰富度有关，还可能与种群数量的差异程度有一定关系。

土壤是微生物生活的大本营，存在大量的芽孢杆菌，芽孢杆菌的种类直接反应土壤的生态状况。石春芝等对神农架自然保护区九大湖调查认为蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌和覃状芽孢杆菌是主要种类，巨大芽孢杆菌也有分离，但不是主要种类。张华勇等研究红壤不同生态条件下芽孢杆菌的变化情况中发现，巨大芽孢杆菌随耕作程度增加逐渐成为优势。本文采用的稀释平板法虽然不能全面反映采样地的实际情况，但可以反映芽孢杆菌在土壤中的存在情况。

四、主要菌株的分离与鉴定

（一）苏云金芽孢杆菌的分离与鉴定

苏云金芽孢杆菌（Bt）是一类革兰氏阳性、产芽孢、不同亚种可产生不同形状蛋白晶体的杆状细菌。其晶体蛋白已成为应用最成功、前景最好的生防农药。苏云金芽孢杆菌广泛分布于昆虫、土壤、仓贮尘埃、污水之中。基于土壤蕴含着丰富的微生物资源及地域多样性赋予了土壤中微生物种类多样性的特点，土壤成为筛选不同种类和基因型Bt原始菌株的最普遍、最直接的来源。自20世纪80年代以来，Bt分离方法力求快速、高效而不断改进并趋于成熟，全世界被分离出的Bt数量大大增加，种类增加。故鉴定Bt类别成为一项重要的基础性工作。

1、苏云金芽孢杆菌的分离

与其他芽孢杆菌相同，苏云金芽孢杆菌的芽孢由外向内分为芽孢外壁、芽孢衣、皮层、芽孢内壁、原生质膜和原生质体。其中皮层的主要成分是肽聚糖，不含营养细胞所具有的多聚糖磷壁酸，所以皮层保持着芽孢的脱水状态和耐热性，另一方面，芽孢形成过程中，会产生大量DPA-Ca螯合物，使得芽孢中的生物大分子形成耐热凝胶，在80℃下热处理20min，苏云金芽孢杆菌芽孢也不会死亡。而且休眠的芽孢在75℃的亚致死温度下处理15min，活化效果最好，不但可促其快速萌发，还可提高芽孢的成活率。依据这一特性，可实施温度筛选。温度筛选分离范围广，不易漏筛，但工作量大，而且Bt要达到一定浓度。

1、2利用醋酸钠进行选择筛选   苏云金芽孢杆菌芽孢的萌发，直接受pH值影响：当pH值为7.0时，芽孢萌发率在85℃以上；当pH低于6.5或高于8.5时，芽孢萌发率极低。因此，加入适量醋酸盐的培养基可选择性地抑制Bt芽孢的萌发，经热处理而被杀死，从而消除干扰菌以达到高效分离筛选的目的。用该方法筛选Bt，可有效抑制蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的生长，使得菌落与Bt类似的干扰菌大大减少。

该方法简便，易操作。将土壤样品干燥后研碎，撒在灭菌的滤纸上，使滤纸面上均匀粘上一层样品粉末，使粘有样品的一面对着培养皿口，轻弹1~2次，然后培养。检出时，由于菌落种类多，数量大，影响目的菌落的特征识别；另外非目的菌落（芽孢菌菌落和真菌菌落）的存在，给纯化带来难度。

抗生素能纯化酶的活性，阻止微生物新陈代谢的某些环节，从而对微生物产生选择性作用。芽孢杆菌中，由于芽孢衣皮层致密、通透性差，抗生素不能进入芽孢内部，无法抑制其萌发和生长。不同种、属的芽孢对抗生素有不同的抗性。苏云金芽孢杆菌除与地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、日本甲虫芽孢杆菌抗性类似外，较其他常见芽孢杆菌抗性显著。抗生素筛选检出率高，效果显著，但由于苏云金芽孢杆菌各亚种之间对抗生素的敏感性不同，个别亚种会因抗生素浓度相对过高而不能形成芽孢和伴孢晶体，因此，抗生素筛选会造成个别亚种的漏筛。将醋酸钠、抗生素分离法合二为一，可显著消除干扰菌，使得土壤悬液的可操作浓度较单一使用醋酸钠或抗生素法高出20~30倍，大大提高Bt的分离效率和出土率。

2、苏云金芽孢杆菌的分类鉴定

苏云金芽孢杆菌被归属为第12类第18群芽孢杆菌的一个种，种下还区分不同的亚种。随着苏云金芽孢杆菌新菌株的不断发现，各种分类方法也被相继提出：将苏云金芽孢杆菌分为不同的亚种、变种、血清学、晶体基因型。鉴定方法主要包括生理生化试验、酯酶法、晶体抗原法、鞭毛抗原法。

苏云金芽孢杆菌各亚种的生理生化特性存在着正与负、强与弱的不同。它们对一些反应会产生不同的阴性或阳性特征，将各指标综合起来，就构成亚种划分的标准。后来随着热解气相色谱法鉴定问世，由于烃类代谢的数量和种类不同，苏云金芽孢杆菌大多数亚种都能得到有明显差异的“指纹图”，热解气相色谱法鉴定苏云金芽孢杆菌省时、快速，为鉴定过渡到使用现代化技术展现了广阔的前景。

苏云金芽孢杆菌的鞭毛主要由鞭毛蛋白质组成，它具有抗原的特性。在苏云金芽孢杆菌的鉴定中，血清型是一项重要的鉴定指标，这项指标特异性强，稳定可靠，被普遍接受和采用。1962年，Barjac对24个产晶体的品系进行生理生化和血清型研究，将Bt分列为6个血清型下的8个亚种。到2006年7月，Bt血清型已达到71个，血清型亚种达到94个。

3、苏云金芽孢杆菌cry基因的鉴定

随着生物化学、遗传学、分子生物学等学科的发展，1981年美国的Szhnepf和Whiteley克隆了苏云金芽孢杆菌的第一个cry基因（编码苏云金芽孢杆菌蛋白晶体的基因被称作cry基因），并于1985年发表了它的核酸序列。1989年该基因被命名为cryIAa，标志着Bt鉴定的研究进入了分子时代。1995年，Cricknore等在第28届国际无脊椎动物病理学年会上提出了新的cry基因命名原则，使得cry基因的分类趋于完善。现行分类系统根据δ-内毒素氨基酸序列的同源性确定出4个分类等级。

血清型等鉴定结果不能反映出Cry蛋白的类型，因此菌株命名与杀虫活性之间失去了联系的纽带，通常cry1、cry2、cry9编码蛋白对鳞翅目害虫有杀灭活性；cry1B、cry1I、cry3、cry7、cry8、cry18编码蛋白对鞘翅目害虫具有毒力；cyt1、cyt2、cry2、cry4、cry10、cry11、cry16、cry17、cry19、cry24、cry25、cry27、cry29、cry30、cry32、cry39、cry40编码毒杀双翅目害虫的蛋白；cry5、cry6、cry12、cry13、cry14、cry21编码蛋白可杀灭线虫。Cry基因的PCR扩增技术，不仅可以鉴别Bt菌株cry蛋白的杀虫特性，还能找到新型菌株，对于研究Bt资源的多样性，预测其杀虫活性具有重要意义。

1996年台湾学者Kou和Chak创立了一种新的鉴定方法，即PCR-RFLP法，适用于对多种基因型的通用引物进行PCR扩增。用2种特异性内切酶消化扩增产物，根据不同的基因型会产生不同长度的酶切片段，经电泳分析，记录差异来断定菌株的基因型。目前，中国农科院植物保护所宋福平等进一步优化了cry2、cry3、cry4/10的通用引物，将鉴定级别提高到了cry基因的第3等级，并进一步将台湾学者鉴定的11种cry1/7/9基因型扩大到29种。Sauka等利用cry1I的PCR-RFLP鉴定体系成功对202株Bt菌株进行了鉴定。

特异性PCR鉴定是在PCR基础上建立的复合引物鉴定方法。其引物有通用引物和高度同源的特异性引物之分，如以色列等人用通用引物从菌株中鉴定出cry9基因后，又用特异性引物区分出cry9A、cry9B、cry9C、cry9D，并检测出一株推测应为cry9E的新菌株。这种方法用于鉴定已知基因是准确的、特异的，但对于新基因鉴定还需借助其他研究方法，并且特异性引物系统设计耗时、耗资金。

不同cry基因可能会有45%的同源性，但在染色体上的保守区域中，同源性高达95%。因此，可设计保守区探针核和可变区探针来检测新的Bt基因。澳大利亚学者Beard等在用杂交方法鉴定cry新基因时，设计并使用了8个基因家族（10个不同cry基因）的通用探针，他们将实验分为2步，第1步用通用探针做Dot analysis，确定被检测出基因的基因型，再对比2步试验的结果，找出新型基因。但此方法首先要设计并合成大量DNA探针，并且较PCR鉴定耗时费力，新基因确定的类型仍然未知，需要借助其他方法作进一步鉴定。

基因芯片的杂交可高效测定微生物中某一特定序列并进行全基因组水平检测，比较不同样品间mRNA转录及表达水平，从而揭示不同生长条件、发育阶段、药物处理情况下的基因表达。目前PCR-Based芯片技术和寡聚核苷酸探针设计也被应用于cry基因的鉴定。如刘旭光等建立了一种不经PCR扩增而直接应用寡聚核苷酸芯片从Bt总DNA中检测cry基因类型的方法，检测结果具有很高的可信度。应用寡聚核苷酸做探针，可大规模、高通量、真实地反映基因组中存在的功能基因，鉴定方法是适应基因组时代的强有力的技术之一。

对cry蛋白进行鉴定可最直接、最准确地获得Bt基因型，杀虫活力等相关信息，并可确定哪些基因被表达。Masson等研究蛋白时，用胰蛋白酶消化被测蛋白，用高效液相色谱对蛋白进行分析，在同标样相比较时，成功地分辨出cry1C、cry1D、cry1Ab的存在。但此法仅适用于对已知基因所表达的蛋白的鉴定。目前，对于cry蛋白测序而言，虽然真实性非其他方法所比拟，但由于存在许多技术性问题，如纯化、费用昂贵、步骤繁琐，较基因操作复杂等，还不具备应用条件，但它最具科学性，最具有发展前景。

（二）枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定

 枯草芽孢杆菌是一种短杆状、无荚膜、能运动的革兰氏阳性细菌，内生芽孢，其分布非常广泛，在土壤、湖泊、海洋、动植物体表等处皆能发现。枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，因其制剂是无毒、无残留、无污染的绿色添加剂，故具有广阔的发展前景，并在饲料添加剂、污水处理、生物农药、疫苗载体等各方面已经得到了广泛的应用，显示了巨大的社会效益和生态效益。试验自土壤中分离得到1株枯草芽孢杆菌，并对该菌株进行了鉴定，旨在为枯草芽孢杆菌基因功能的研究以及进一步开发利用奠定基础。

1、1试验样品   新鲜土壤，从山东省菏泽市某村田地土壤表层约10cm下采集的肥土。

DNA聚合酶、各种限制性内切酶，pMD18-T载体，超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和细菌DNAout（G+），E.coli

将采集的新鲜土壤加到营养肉汤培养基中，37℃培养18~24h，然后放于75~80℃水浴中热处理10~15min。

将热处理后的培养物用平板划线分离法涂布于普通琼脂平板上，37℃培养18~24h；选取生长良好的菌落反复接种，经数次琼脂培养基培养筛选，挑选在培养基上呈单个、灰白色、不规则、菌落边缘不整齐、表面粗糙的干燥型菌落镜检、观察并进行纯培养。

1、5、1细菌的生化鉴定   根据《伯杰细菌鉴定手册》对分离细菌进行常规的生理生化鉴定。

枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取：挑取枯草芽孢杆菌单菌落接种到5mL营养肉汤中，37℃振荡培养过夜，参考细菌DNAout（G+）试剂盒说明书提取全基因组。

PCR体系与反应条件：以提取的枯草芽孢杆菌全基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增。反应体系（25uL）：DNA模板2uL，10×PCR PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。

目的片段的回收、纯化及序列测定：参照超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明回收纯化目的片段，然后将其与pMD18-T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑斑，扩大培养，抽提重组质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，将鉴定为阳性克隆的菌液测序。

16S rRNA基因序列分析：利用DNAStar软件对所测定基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑，并与GenBank中的序列进行同源性比较。

在普通营养琼脂平板上，菌落为圆形，边缘不规则，表面有皱褶，挑取单个菌落涂片，可见革兰阳性、直杆状细菌，常成对或呈链状排列，在营养条件贫乏或生长条件不利的情况下形成芽孢。

2、2生化特性鉴定结果

细菌的生化鉴定结果为接触酶反应阳性，利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇且产酸，利用柠檬酸盐，不利用丙酸盐，不形成吲哚，水解淀粉，可使明胶液化。

上述结果均符合枯草芽孢杆菌的生化特性，初步证明分离菌为枯草芽孢杆菌。

  （1）根据芽孢杆菌耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压的特性，试验采用的75~80℃水浴中热处理10~15min的样品处理方式，从一定程度上简化了细菌分离的繁琐性，使分离细菌的操作简单化。

（2）本试验从新鲜土壤中分离得到1株革兰阳性杆菌，其形态特征以及生理生化特征与文献报道的枯草芽孢杆菌的特性是一致的，但是由于细菌生理生化性状的可变性以及某些细菌生理生化特性的相似性，因此用常规的生理生化指标测定很难得到准确的鉴定结果。枯草芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌细菌形态特征及其生理生化特性及其相似，在伯杰氏细菌鉴定手册（1984年版）和国内其他参考文献中都没有查到这两类菌的明显的区别，因此从形态特征及其生理生化特性只能初步证实分离细菌为枯草芽孢杆菌。

  （3）为进一步证实分离得到的细菌为枯草芽孢杆菌，试验在生理生化鉴定的基础上又进一步做了分子生物学鉴定。16S rRNA基因序列分析在微生物种群分析方面应用广泛，已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。16S rRNA是核糖体小亚基的骨架，在结构上分为保守区、半保守和非保守区，保守区序列基本恒定，半保守区和非保守区序列因不同种、属细菌而异，一般不同属细菌16S rRNA基因同源性为70%~90%，而同种内不同株间基因同源性>99.5%。本试验扩增的16S rRNA基因的同源性达到99.6%，大于99.5%，进一步说明分离细菌为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌种。本试验分离的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌功能基因及其相关研究奠定了基础。

一、医院药学常用仪器设备的配备

现代医院管理学将医疗设备分为诊断设备、治疗设备和辅助设备三大类，每类又分8-10小类。医院药学的仪器设备主要包括在诊断设备类的实验室诊断设备中和辅助设备的制药机械设备、医用数据出现现代医学科学的重点。近年来随着医院临床药学和药物研究工作的深入开展，现代化的药学仪器设备不断涌入了医院，医院药学仪器设备的科学化管理已成为刻不容缓的任务。现代医院药学的仪器设备至少分为制剂仪器设备类，包括药物提取，加工各种制剂的设备；药品检验仪器设备，包括常用的天平、电冰箱、恒温箱等基本设备和光分析设备等；临床药学仪器设备，主要包括用于血药浓度监测的贵重分析仪器，如高效液相色谱仪、荣耀分光光度计等；药学管理设备，主要是电子计算机和相应药学管理的数据库。现将现代医院药学应配备的常用仪器设备的名称、特点和主要用途作一扼要说明。

医院药物制剂常用粉碎、过筛、蒸馏、蒸发、加热干燥和冷却等设备，主要用于药物的加工和各种制剂的制备。

（1）截切机：由输送器和切刀组成，适于茎、叶和韧性要挟药材的截切。

（2）截切粉碎机：与万能粉碎机相似，转子和粉碎室中均装有网刀，适于韧性和纤维性药材的粉碎。

（3）研钵：有瓷制、下班制和玛瑙制几种，适于少量药物的粉碎。

（4）铁研船：有手推、足蹬和电动三种，适于质地松脆、吸湿性小，不与铁起反应药物的粉碎。

（5）胶体磨：由上下磨器组成，配以精密控制粉碎面装置的特种靡，可得直径1μm以下的微粒，常用于制备混悬液和乳浊液。

（6）电动冲钵：为间歇性粉碎工具，适于含挥发油和易粘结成块药物的粉碎。

（7）球磨机：由不锈钢或瓷制圆筒，内装一定数量和大小的圆形钢球或瓷球构成，适用于结晶性、脆性药物及非组织性中药的粉碎。亦可用于区菌药物的粉碎的混合。

（8）万能粉碎机：粉碎室中转子和盖上都装有若干相互交叉排列的钢齿，药物被避剧烈转动的钢齿撕裂、襞裂和研磨，在气流作用下经环状筛板分离出细粉，适于粉碎各种干燥非组织药物、植物的要茎皮等。此类粉碎机尚有旋钟式和打板式的

（9）流磨机：系用高速弹性气体（空气、蒸气式惰性气体）使药物颗粒相互碰撞而产生剧烈的粉碎作用，经分级器可分出5μm以下的极细粉。适用于抗生素、酶、低溶点和其它热敏性药的的粉碎。

（10）滚压机：由两个沿水平轴以相对方向旋转的滚筒组成，适于脆性药物的粗粉碎。

（1）手摇筛：筛网由铜丝、铁丝、不锈钢丝、绢、麻和尼龙丝编织成，固定于竹、木、金属圈上制成圆形或长方形。主要用于小量、毒剧、刺激性性质轻药粉的筛析。

（2）悬挂式偏重筛粉机：利用偏重轮的转动而产生振动，筛同的毛刷随时将药粉刷过筛网。适用于矿物药、化学药及显著粘性药材粉末的过筛。

（3）振动筛粉机：利用偏心轮对其连杆产生入复振动筛析药粉。适于无粘性植物药和化学药筛析。

（4）电磁簸动筛粉机：振动幅小（3mm内），频率高（每分钟200次以上），有较强的振动荡性。适于粘性较强药粉的过筛。

3．混合器械有混合筒、槽形混合机的双螺旋锥形混合机，用于两种以上药物或赋形剂的混合。

4．滤材有多孔滤板，常用垂溶玻璃漏斗、滤球、滤棒等，近年有微孔滤膜系高分子多孔性薄滤材。用于阻留液体中固体性物质。

5．蒸馏设备有小型常压蒸馏装置、小型减压蒸馏装置和水蒸汽蒸馏装置，常用于药物的精制、液体的浓缩及有机溶媒的回收等。

6．蒸馏水的蒸馏设备常用塔式蒸馏水器、高纯度蒸馏水器和多效蒸馏水常与水质过滤器、离子交换器和电渗析器配套应用于大输液中注射用水的制备。

7．蒸发设备夹层蒸发锅和小型减压薄膜蒸发装置，用于常压或减压的药物浓缩精制。

8．干燥设备电热恒温干燥箱、喷雾干燥装置、电热真空干燥箱、红外线与远红外线干燥箱等，适用于药物的加热干燥；冷冻干燥设备适用于热敏性药物如生物制品、抗生素和一些固体注射剂的制备。

9．封闭式电冰箱用于药物的制备和某些药品的贮存，存放易燃药品则使用防爆冰箱。

10．压片机撞击式单冲压片机和旋转式多冲压片机，用于片剂的制备。

11．包衣机由包衣锅、动力部分、加热器和鼓风设备组成，用于制备糖衣片。

12．灌封设备手工单针灌注器和双焰溶封灯用于少量小针剂的生产；大量生产可用安瓿自动灌封机；大输液大批量生产可用自动灌装流水线设备。

（二）药品检验仪器设备类

医院的药检主要是对自制制剂和其半成品进行鉴别、检查和含量测定，对购入的、库存的或质量可疑的药品原料或成品进行检测，一般以快速检测为主。因此，齐全、先进的仪器设备不仅能保证医院药品质量监督的实施，同时也反映出医院药学工作的水平，特别近几年临床药学工作中血药浓监测的开展，促进了药检工作现代化仪器齐备配置的步伐。

1．常用玻璃仪器中主要有容量玻璃仪器如量瓶、吸理管、滴定管、量筒等；一般玻璃仪器有分液漏斗、称量瓶、碘量瓶等。

2．分析天平TG328A型电光分析天平，最大称量200g，分值0.1mg，机械加码范围10-199.9g，光学读数全量值10mg ,光学读数最小刻度值0.1mg ，系万分之一分析天平，最大称量20g ，分度值0.01mg，机械加码范围1-99mg，光学读数范围0.01-1mg，光学直读数0.01mg.。

3．旋光计是用来测定物质旋光度的仪器。含有不对称碳原子的化合物液体或溶液，均有一定的旋光度，物质的旋光度又因测定时的温度、光源、溶剂、浓度及杂质含量不同而变化，故可利用旋光度业检查物质的纯度或测定药物在溶液中的浓度。

（1）目测式旋光计：国产WXG圆盘旋光计，最小读数为0.05°,精度较差，可作为半成品检查。Zeiss Windel类（原西德）、Shimadzu类（日本）目测旋光计精确度可达0.01°。

（2）WXG和WZZ-2等自动指示旋光计。

电位法测定pH值系利用电极在不同溶液中所产生的电位来确定其pH值。淀时将指示电极和参比极组成一电池浸入溶液中，其产生的电动势力与溶液的pH值有关，参比电极的电位保持恒定，指示电极的电位随溶液的pH变化而改变，利用直读法或补偿法溶液的pH值。常用的参比电极为饱和甘汞电极，常用的指示电极为玻璃电极。它可有用于有色、胶体、粘体、粘稠或混浊液及半固体物质等的pH值测定和pH滴定，酸度计还可用用测定电动势和用于电位滴定。常用酸度计有雷磁25型酸度计和PHS-2型酸度计。

5．折光计 物质在一定条件下，常具有一定的折光率，当混有其它物质时，其折光率亦随之改变，故可由折光率测定来鉴别不同种类的油类与检查各油类的纯度。若某物质中含有其他物质，则因所占份量不同而显示出不同的折光率，因此也可由测定折光率来计算某些溶液的浓度。

6．可见分光光度计 可用于有色溶液和可显物物的分光光度测定。常用仪器有72型、721型、722型、XG-125型、7211型，均为国产。

7．单波长单光束紫外一可见分光光度计 常用仪器中有手动式的国产751型、751G型、7520型、722型、WFZ80-D2型、752型、753型、英国SP-500型、日本QV-50型；具微机数据处理功能式的有国产WFZ800-D3型、53WB型、752GW型、752C型，美国DU-8型。

8．单波长双光束分光度计 常用仪器有国产730型、740型、日本岛津UV-200型、UV-210型，英国SP700型、SP800型。近年来，微机处理使这一类型的分光光度计功能昌趋完善，不但自动化程度提高了，而且能承担复杂的计算过程，如国产790型，美国P-E554型，P-E55XY7型，英国SP8500型、日本日立UV-340型、UV-3400型、岛津UV-240型、UV-250型、UV-260型、UV-265型、UV-356型、UV-160型、UV-2100型等。

物质分子在红外线范围的磁场中接受能量，当辐射能量（或频率）与它的各种频率（即能级）相同时，就会吸收能量而发生共振，于是就产生了分子对红外光线的选择性吸收，所以，分子吸收红外线能量是量子化的（即为不连续的），其运动能级变动和紫外吸收光谱一样，也服从于量子力学的规律。但红外线的能量比紫外线低（低动能级跃迁是电子能级跃迁所需能量的1/100-1/10），不能引起电子能级跃迁，即不产生电子吸收不谱。红外光谱是由于分子中振动的能级跃迁，并伴随分子中转动能级跃迁而产生的，所以红外光谱又称振动光谱。红外光谱分析用于鉴别化合物的类属，如有机物和无机物，芳香族和脂肪族、链状或环状构型、饱和不饱和化合物、芳香族的单核与多核，确定官能团及其人类和推测未知物的化学结构。

10．RC-3B型药物溶出仪 溶出度系指药物从片剂或胶囊等固体制剂在规定溶剂中溶出的速度和程度。凡检查溶了的制剂，不再进行崩解进限检查。

开展临床药学的重点和难点是测病人的血药浓度，没有现代化的仪器设备很难开展此项工作。近年来除了应用紫外分光光度计外，高效液相色谱仪、气相色谱仪、荧光分光光度计等正被引入医院药科学，从而促进了临床药学的深入开展。

1．荧光分光光度计 主要有光源、滤光片或单色器、检测吕器、样品池、数据处理机及显示装置等部件组成。某些物质受紫外光或可见光激发后能发出比激发光波长较长的荧光，被物质吸收的紫外光称激发光，产生的荧光称发射光。荧光光度计通过测定发射光的强度而进行定量分析。

2．原子吸收分光光度计 主要有光源、原子化器、单色器、检测器、数据处理机及显示器等部件组成。它有别于其它光光度计，光源通常用由待测元素作为阴极的空心享受极灯，原子化器由雾化器及燃烧灯头或石墨炉组成，燃烧火焰由不同类型的气体混合物产生，常用空气一乙炔火焰。适用于药品或生物样品各种元素的定量、定性分析。

本类仪器按射电磁波是连续波或脉冲波分两在类。现多用脉冲富里叶变换核磁共振波谱仪。主要有磁体（电磁铁、永磁铁、超导磁铁）、电子控制台、计算机及数年记录仪等部分组成。除另有规定者外，一般都是采用照射频率为60-100Hz，可测氢（¹H）、碳（¹³C）、氟（¹⁹F）及磷（³¹P）等核的仪器。本仪器可以判定有机化合物分子中氢原子所处的位置及各种功能团和在骨架上氢原子的相对数目。用于药品的结构分析、纯度检查、分子量测定、含量测定、动力学研究等。

同流动相及贮液器、输液系统（泵）、进样系统、色谱柱、检测器及记录仪（或积分仪）等六个部分组成。其工作过程是将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等作为流动相，用泵将流动相压入装有填充剂的色谱柱，注入供试品，经流动相带入柱内，在填充剂上分离后，按成分先后进入检测器器，用慷仪慷色谱图。据色谱图上的峰面积（或峰向）及保留时间，进行药品和生物样品的定量、定性分析。

5．气相色谱仪 由气路系统、进样系统、色谱柱、检测器、记录器、显示器及数据处理机等组成。它适用于含挥发性可经裂解、衍生等处理后能气化的药品及组分混合物的定性、定量分析

6．薄层扫描仪 （High-sped Thin-Layer ChromatoScanner,HTLCS）系指用一定波长（紫外或可见光）的光照射在薄层层析纸上，对色谱斑点进行扫描，以达到定性、定量检查样品的仪器。

7．TDx快速血药浓度检测仪 是采用荧光偏振免疫?

■［此处缺少一些内容］■

（四）药学管理仪器设备类 医院药科学的现代化管理在我国刚刚起步，其中最关键的是将计算机引进了药学管理，现要常用的计算机有IBM、286、386、486、586型，有关药学管理的软件逐渐在系统化，如药品管理系统包括药品供应、药库、麻醉药品、药检、药品质量监督管理系统和药品收发管理自动化网络系统，临床合理用药系统，药代动力学和生物剂学程序包以及药学情报资料管理系统。计算机软件在医院药学中开发、研制、应用前景十分广阔，将在医院药科学的一体化管理中发挥更大的作用。

二、医院药学仪器设备的采购

医院药学仪器设备的装备工作是医院医疗设备管理系统工程的重要组成部分。根据医院发展对药科学的要求，有计划地购置药学仪器设备，是实现医院药科学现代化的重要保证。医院学仪器设备的采购应在院长在直接领导下，由药剂科提出计划，经医疗设备管理的主管部门具体实施。作为药学工作者应该了解有关采购的药学仪器设备制定计划的原则，编制计划的程序，贵重仪器设备计划的可行性论证和采购途径等内容。

（一）药学仪器设备装备的原则

参照卫生部拟定的装备标准，在考虑药学仪器设备的装备时，应遵循经济和实用的两个原则。

1．经济原则 所谓经济原则，即按经济规律办事，讲求投资的经济效益，力求用尽可能少的费用取得尽可能大的实际效果和尽可能多的经济效益。实现经济原则的关键是实行计划管理，用计划来组织、领导、监督、调节仪器设备的。遵循有计划、按比例发展的规律和价值规律，使人力、财力、物力得到充分有效的利用。

经济原则还含有节约的意义。使现人的仪器设备要最大限度地发挥作用。加强使用管理和维修管理，尽量延长使用期限。不应脱离实际追求高自动化、电子新技术仪器设备。

应根据医院药科学的任务、规模、技术人员的技术水平和技术条件的现状，适当考虑将来的发展而确定仪器设备的装备标准。要从需要和可能出发，按照轻重缓急统筹规划，分期分批的更新设备，逐步充实配套，在有条件装备或引进设备时，则需从实际的原则出发，优先考虑基本设备，其次再考虑高、精、尖的设备，也就是先搞“常规化的武器”的现代化；在仪器设备的选择上要立足于国产仪器，首先装备国产仪器，在此基础上适当引进国外万能设备。在目前，引进设备就友提高“技术精度”的关键设备为主，不宜急于引进大型的万能设备，要充分发挥仪器设备的功能，力争投资少实用性大。

医院药学仪器设备的选择，是管理的第一个环节。传统的管理，往往从仪器设备的使用开始，而忽视闻“选择”这个重要环节。选择不当，必然造成仪器设备管理上的先天不足，则难以达到预定的目标。

1．做好预测 预测是建立在情报工作的基础上，据某种仪器设备的历史和现状的资料推测未来，或研究未来的发展状况。预测的任务就是根据目标（某仪器设备的发展规划）的要求，研究在实现这一目标过程中，如何摆脱盲止行动，指出仪器设备在不同条件下的发展结果，并尽可能提出可供选择的各种对策，通过科学方法，为制定规划方案提供依据。

规划是根据医院攻学业务技术的发展，对一个时期或一处范围的仪器设备的总体战略布局，目的保证正确的发展方向。所以规划的任务是确定适合医院经学发展的战略目标，以及实现战备目标的主要措施。医院药学仪器设备发展规划未被重视，没有列入医疗技术发展规划的组成部分，其关键在于没有规划置于战略管理的地位。系统管理的目标是提高效率，但战略管理更为重要，若方向不对，则效率越高，效果就越坏，浪费也越大。

制定仪器设备规划的主要依据是医疗技术发展规划的要求，仪器设备发展现状和自身发展的需要，以及人力、物力、财力的可能条件，使仪器设备的发展不致于超越实际的可能性。由于现代化仪器设备的发展日新月异，医疗、科研、教学等工作对仪器设备的要求也越来越高，不确定因素增多，增加了制定规划的难度，用传统的自下而上的汇总方法，已不适应制定规划的要求，应采取系统论证方法来制定仪器设备的发展规划。系统论证的要求。

（1）把规划对象作为一个有机整体，制定规划时着眼于整体效能，采取自上而下的程序。首先明确整个系统的目标和设想据此确定各分系统的目标和任务，并把各分系统和单项仪器设备的发展放到整体中去权衡，求得全面发展。

（2）形成系统论证的一般程序（步骤）

①明确规划对象、即制定何种规划。

②调查研究，收集资料。

③进行预测，提出发展方向和整体目标。

④根据整体目标，拟定各分系统目标和发展项目。

⑤对整体与分系统目标进行综合平衡、方案。

⑥提出实现规划目标的主要措施、方案。

⑦进行可行性研究，最后作出结论。

3．重视情报工作 目前有医疗单位，由于情报无人负责，信息不能及时反馈、适时调整，以致出现反复购入质量极差的产品，造成极大浪费。有产引进国外的仪器设备，困订货情报资料不明，漏汀或错汀仪器设备相应的配套附件，以致长期闲置，无法使用。另外，还有不少国外进口的仪器设备，因缺少情报资料，无法操作和维修。因此，选择仪器设备时，首先要做好情报资料工作。

仪器设备情报收集的内容主要包括两方面：一方面是要对先进技术水平的产品，要通过资料调查摸清这一领域当前的世界水平，其次了解这一产品的技术性能、同类立产品的比较参数、市场价格、运输条件、交货速度等；另一方面是指专利使用权、

技术知识使用权和商标使用权等，通过资料调查，摸清它的技术价值、主要特征及是适合我用。

查找仪器设备情报的主要途径有：国内餐期刊、文摘和索引，国内外大家样本、专利文献及索引，国内外的展览会、展销定货会、各医疗单位仪器设备动态等。

（1）依据：购置计划必须以财务预算为依据，财务预算则必须以事业计划为依据，三者必须一致，互相衔接，以免在管理上产生混乱。

（2）可能性：指购置设备的资金来源（引进设备尚须知外汇额度）是否已比落实。

（3）条件：指使用这一类设备所需的条件是否具备。要逐项考虑有无使用、安装、维修、保养的技术力量，有无房间空间。若无创造条件的具体措施，则不宜急于购置。

（4）需求评价：购置引项设备是否合理，临床需求的必要性和迫切性，有无其它可供选择的替代方法。

（5）技术评价：从设备的性能指标、技术参数方面进行技术上审查，考虑设备的行进行，可靠性和适用性。

（6）造型：选择最恰当的厂牌、型号、规格。对精度的选择，要从实际需要出发，不能盲目追求高、大、精、尖，应讲求实效。引进仪器设备注意不要引进已经或将要淘汰的设备，注意试剂、消耗材料及零配件的补充，注意主机和标准件是否完整。

（7）维修性：选择设备时，要考虑设备维修和修理工作量及费用。对于设备本身是否易于拆卸修理，供方提供维修服务和有关资料、技术、零配件的可能性和持续时间均应考虑。

（三）仪器设备计划的编制

仪器设备计划应在任务明确，方案经充分论证后再编制，使计划与任务一致，需要与可能一致。

1．仪器设备计划的类别和编制要求

（1）进口仪器设备计划：在外汇指标许可范围内和国内人民币落实的前提下，可申请向国外订购，按年度编报进口计划，于每年8月底提出下年度计划，按各单位归品上报编报计划应填写“订货卡片”、“订货卡片说明”。订货卡片上所列各项均应认真填写，字迹清晰，英文最好打字并留行距。对规格、型号、技术要求、国别厂名行等，填写后要核对。附件、备用均要列出清单，填不下可另附表。单价和金额应尽量估计准确，最好以国外厂商的报价单作参考。用途指仪器设备本身的用途。用于教学、科研订货。可申请免税，订货卡填妥扣要另盖公章。

（2）贵重仪器设备计划：一定限额以上的国产仪器设备，需于每年8月底前编报下年度计划。属于国家计划分配品种按归口上报，通过订货解决，其它经市场采购解决。

（3）专题计划：为完成重点任务或科研课题需要，便于仪器设备配套和同步解决，可编报专题计划，要求以级专题解决，同量要组织学专门人员落实。

（4）临时计划：为适用临时医疗任务或科研项目需要，可提出临时需要的仪器设备计划。

（5）不宜编制计划的情况：资金无来源，规格型号和技术性能不清，使用率不高，产品落后，安装条件、仪器操作和维修力量未落实。

2．大型仪器设备计划的技术咨询

仪器设备计划编制是否科学、合理，要注重发挥专家内行的作用，广泛进行技术咨询。对于大型仪器设备，应邀请行家对选购计划进行技术论证，提出咨询意见，为领导决策提供选择方案。

3．仪器设备计划的审核

主要从三方面进行审核：需要性审核，计划的必要性、迫切性、合理性；技术性审核，型号、规格、性能和指标等；行政性审核，经费的可能性及协作合办、人员配备等。经医疗设备管理委员会审后报主管领导批准。

实施仪器设备计划主要有两个途径，一是通过计划分配（订货），一是通过市场调节（采购）。计划分配是使用部门通过计划提出申请，由国家物资管理部门进行综合平衡，分配指标，采取订货或国家物资供应网点等方式组织供应。市场供应一般采取计划申请，核实供应和敞开供应。市场采购方式有会议订货、委托采购、函购、就地采购到产地采购等。

（1）国外订货：申请进口仪器设备或零配件，均需按进出口公司或有关部门规定，首先填报体贴卡片，经主管部门审批同意扣，由各进出口公司统一对外联系订货，及时将与外商联系的情况告知订货单位。当接到进出口公司征询单时（国外报价单、产品规格型号和技术性能等意见），要及时组织有关人员认真研究，立即给予答复，不要超过期限。发报价超过原俣价额，应及时按类务归口渠道办理外汇手续。当接到国外合同时，要逐项仔细核对，无误时立卷、保存，并提前做好接收仪器设备的准备。

（2）国内订货：申请国内计划分配的仪器设备，应按上级要求和下达的指标参加订货会议，签订供货合同（协议）。参加订货的人员必须熟悉订货计划，确保产口质量。在签订合同时，对所订仪器设备的品名、规格、型号、技术指标、质量要求、订华数量、价格、交货日期、交货地点、方法、验收条件、付款方式等项目都要有明确要求，以条款方式下来，经双方确认盖章生效。订货合同具有法律效力，违约者要承担法律责任放经济损失。订货合同落实后，要做好接货准备。

（3）招标：是一种有效的方法。随着国际效的增加，采取招标方式采购仪器设备，可以合理的低价买到适合使用要求的优质设备，对有效利用资金引进先进设备和先进技术，有一定的积极作用。

（1）常规采购：采购包括本地采购和外地采购，应以本地采购为主。采购人员要熟悉市场货源情况，积极疏通业务渠道，组织来货源。特殊要求的仪器和零配件条积极联系加工订购。对市场短缺品种，要及时与有关方面联系协商解决办法和完成途径，对未落实品种，要及时给申请者回复。

（2）函购：凡能函购解决的问题，尽量不派人外出采购。函购能节省人力物力，增加供应渠道。

三、医院药学仪器设备的使用规范

医院药学仪器使用管理的任务有两个方面：一是保证仪器设备的安全，包括数量上的准确性和质量卢的完好性，以便完整地保持其使用价值；二是提高仪器设备的使用率，充分发挥其医疗效益，追求更多的社会效益和经济效益。仪器设备使用的规范化管理涉及管理思想、制度建设、财产帐目、技术档案建立、使用率调查以及教育培训等六方面问题。管理思想方面要求充分调动使用人中的积极性，增强责任房，爱护公共财物，把设备管好用好；提倡专管共享，协作共享，提高使用率。制度建设方面应健全。到货、验货、仓储、分配发放，在用设备管理（包括技术档案、操作规程、调配、组织共用）、献策产清点、退库利用及调剂处理、报废等一系列规章制度，力必使财产帐目健全、帐帐相符、帐实相符。技术档案方面，对贵重精密仪器设备建立技术档案。贵重精密仪器设备的划分可采用价格与精密度相结合的方法，一般指价值1万元以上的仪器，也可在5000元以上的仪器，或价值虽不足规定金额，但其精密度甚高，应特别注意保养的，亦可划入贵重精密仪器齐备。

（一）医院药学贵重仪器设备的使用要求有三方面

1．贵重仪器设备的要求：

（1）有专人保管（应熟悉该仪器设备的性能、使用等）。大型精密仪器设备应有专人使用。

（2）设立技术档案（包括订货合同、说明书、验收记录、主件及附件清单、登记卡片、操作规程、保养和维修记录等）。

（3）有使用记录和性能动态记录。

2．贵重仪器设备使用操作人中职责：

（1）严格遵守操作规程和仪器管理规定。

（2）爱护仪器设备，责任心强。

（3）技术操作熟练，经考核合格。

3．贵重仪器设备使用保管人中职责：

（1）保持仪器设备随时处于完好状态，经常检查、保养，及时维修。

（2）检查使用登记情况，发现问题，及量报告解决。

（3）保存技术档案，更换保管人员时，交待手续清楚。

（4）补充零配件及消耗品。

（二）仪器设备的使用管理方法，一般均以帐卡、档案、制度、规定为管理的主要方法。

1．建立仪器设备管理帐以“仪器设备管理卡片”为记帐凭证，做为仪器设备管理和清查时依据，是各种仪器设备各种数据统计的原始资料，但不作为财务结算和物资发放的依据。

2．建立仪器设备管理卡，仪器出库时填写管理卡，并由使用单位人要卡片上任免盖章。管理卡片一式三份，器械科存一份作为管理帐，使用单位二份，一份由使用单位保存，作为清点和管理仪器设备的依据，一份随仪器设备存放在技术档案内。

3．建立技术档案，包括订货合同，发标提货单据，出入库凭证副联，验收记录，产品样本说明书，线路图，安装及运转技术要求，安装调试记录，试验报告，使用操作登记，操作规程，检验记录，维修保养记录，损坏报告及原因分析，零件耗损及补充记录吧及其他有关的一切技术资料。目前多数单位建立精密仪器设备履历书，作为技术档案的主要内容，其优点是便于保存和查阅。技术档案应按统一建立，并设专人专职或兼职管理。原始资料的正本存于技术档案里，仪器设备说明书、线路图等复印件一份随仪器设备存放于使用单位处，对贵重精密仪器可设“精密仪器使用设备维修记录簿”，由保养人负责管理，每次使用后，要逐项登记日期，使用时数，使用人等，使用人签名后由保养人验收签字。每将近更换新册时，应将旧册存入技术档案。

4．建立相应的仪器设备使用管理的制度的规定：

（1）计划编审与审批制度；

（2）采购验收及仓库管理制度；

（3）设备技术档案制度；

（4）仪器性能精确度鉴定制度；

（5）仪器使用操作规程；

（6）设备作用、维修、保养制度；

（7）设备使用人员考核制度；

（8）设备的领发、破损、报废、赔偿制度；

（9）仪器设备使用安全制度。

如果这些制度订的严密合理，岗位责任制明确，并严格执行，仪器设备管理工作流程必然处于一个良好的状态。在仪器设备使用率方面，应克服盲目引进和本位主义，提倡仪器齐备专管共用，协作共用或多机联用，以提高仪器设备的利用率。采用多种形式培训设备管理人中和使用人员。以提高仪器设备使用管理的水平。药学仪器设备规范化使用，要求使用人工员具有一定的学识水平，经过专门训练，熟悉仪器设备的性能，并严格按操作规程使用。下面对医院药学常用仪器设备的使用方法作简单介绍，有引起仪器设备需按说明书操作。

1．各种粉碎机械的性能与特点各不相同，应依其性能结合被粉碎药物的物质及要求的粉碎度合理选用。

2．高速运转的粉碎机开动后，待其转速稳定量再加药，否则因药物先进入粉碎室，机器难以启动，引起发热，甚至会烧坏电动机。

3．药物中不应夹杂硬物，以免卡塞，引起机发 热或烧坏。如铁钉等进入粉碎室，长时间磨擦可引起燃烧，在加料总动员人壁附上电磁铁装置可以克服之。

4．各种传动机构如轴承、伞形齿轮等，必须保持良好的润滑性，以保证机件正常运转。

5．电动机及传动构应用防护罩罩好，以保证安全，同时应注意防尘、干燥与清洁。

6．使用时不能超过电动机负荷，以免启动困难，停车或烧毁。

7．电源必须符合电动机的要求，使用前应注意检查，一切电气设备都应装接地线，确保安全。

8．各种粉碎机在使用后均应检查机件，清洁内外各部，添加润滑油后罩好，必要时予以检修。

1．根据对粉末细度的要求，选用适宜号数的药筛。

2．筛内药粉不宜过多，一般为药筛容积的1/4为宜。

3．较大粉粒有能通过筛孔时，应取出重新粉碎，不可用于挤压，以防不适宜的大颗粒通过，或因压力过大而损坏筛网。

4．药粉中含水分较高时，应充分干燥后再过筛；易吸温性药粉，应在干燥条件下过筛，含油脂多的药粉，易粘团成块，可于脱脂后过筛。

5．操作时，应注意防尘，毒剧药及刺激性较强药物过筛时，应在密闭装置中进行，并庆做好完全防护。

6．药筛用完后，应用软乞求刷刷净，必要时用水冲洗，但应及时晾干。

（三）减压蒸馏装置的使用

1．减压蒸馏应选用壁厚耐压的圆底或梨形仪器，禁用平底仪器，以防在受压力不均而引起爆炸，连接处亦需利用耐压像皮管。

2．仪器安装好后，需检查严密情况和所有达到的严密情况。为此，关闭安全瓶活塞，开动减压泵。若压力降不下，则应检查仪器各处连接是否严密，必要时适当调整。从压力计上观察仪器所能达到的减压程度。

3．检查完毕，慢慢打开安全瓶活塞，使与大气相通，然后关闭减压泵，停止抽气。

4．将欲蒸馏的液化倒入蒸馏瓶中，液体量约为其容积的1/2，不可过多。关闭活塞，开动减压泵。

5．达到所需真空度后，将蒸馏瓶浸入热浴，加热蒸馏瓶的球形部分占其体积的2/3，不要触及热浴底。逐渐升温，热浴温度要比蒸馏液的温度出20℃左右。调节进入毛细管的空气量，使液体保持平衡沸腾。

6．在蒸馏过程中要注意观察，记录时间、压力、沸点、热浴温度及镏出液体的速度等。

7．蒸馏完毕，按下列步骤结束操作：先停止加热，移去热源，让蒸馏瓶自然降温一段时间，再慢慢打开螺旋夹及安全瓶活塞，放入空气。当系统内外压力平衡后，关闭减压泵，停止抽气。拆除仪器时先取下接受器，再取蒸馏瓶。

使用时应按要求操作，调节好蒸汽与冷却水的质量和数量。蒸馏水器要定时拆洗，将内壁附着的锅垢除去，注意不能擦破表面镀层。蒸馏水器使用完毕，应趁热将锅内余水放尽，下次使用前再放入蒸馏水，以免盐类及垢物沉积而不宜清洗。

（五）电热恒湿干燥箱的使用

1．使用前应检查温度调节器的性能是否良好，然后根据干燥物质及干燥目的调整至所需温度。

2．干燥时，应打开排气孔，以便箱内水分逸出。有鼓风装置的箱，在加热和发行量温过程中必须开启鼓风机，否则会影响箱内温度的均匀性和损坏的物品。

3．箱内干燥物不可过多过挤，散热板上不应放物品，以免影响热气流的上升。

4．凡能产生腐蚀性及其它有害气体的药材忌用干燥干燥。干燥物含挥发性物质时，应物在空气中挥发后再放入箱内干燥。

5．干燥玻璃皿时，应待其温度降至接近温时再取出，以防止炸破。

6．干燥温度切忌超过被干燥物的熔点。

7．需要观察箱内的物品时，可开启外道箱门，透过玻璃门观察。但以尽量少开为宜，以免影响恒温。特别是箱内温度在200℃以上时，玻璃门因温度骤降而易破裂。

8．用毕，有关开关和旋钮应置于零点或关闭，并切断电源。

1．电冰箱应放在通风干燥处，不得靠近发热体如暖气、烘箱等，并避免阳光直射。

2．冰箱底部应垫10cm高的木架，箱后高墙应在15cm以上，以利空气对流和散热。开门的时间要短，次数要少，以保持箱内温度稳定，延长使用寿命。

3．保持箱内清洁，不得贮放有腐蚀性、易燃性和易爆性物品（如强酸、强碱、乙醚、丙酮等），以防其蒸汽腐蚀或发生为灾。存放热物品时，应待物品冷至室温后再放入。

4．当蒸发器上结冰太厚（5-10mm ）,应融化冰层并清洗冰箱内壁，以免影响机器效能，融冰时，可将温度控制器械上调节钮拧到“融冰”外，或将带有半自动化霜装置的温度控制器“化霜”揿扭按一下，使机械停下，蒸发器上的结冰即会自然融化。待冰霜融化，再调节旋钮至原位，使之重新工作。融冰时，禁用硬物敲击冰层，或用锐器铲除冰霜，以免损坏蒸发器。

5．电源电压不能低于额定电压15%或高于5%，否则机械不能正常运转或造成电机烧坏接电源时，要接在主电路上，箱壳要接地线，以防电路漏电，造成触电事故。

6．根据箱外气温和贮存量的变化，注意调节温度控制旋钮，使箱内温度恒定在4-6℃。

7．当冰箱发生特异响声时，应及时检查一维修。

1．使用前检查天平各零部件是否完好无损，刀垫是否在支架的正确位置，并用软毛刷拭天平盘。

2．检查天平是否放在水平位置，如不符合，可以调整垫脚使其保持水平位置核查供电电源与仪器所标注的电压相符合所接通电源。

3．轻轻开戾升降钮，使天平梁落下，观察指针或光幕上“0”刻度线是否指在零点附近，若偏离零点太远可用调节天平臂上的零点螺丝进行调节；若偏离较小可用底座下面光幕调节杆（钮）调节。

4．使用天平时，最好将称物在普通天平上称得近似重量后，再用带橡皮套的镊子将被称物体置一器皿或衬一隔膜放天平承物盘内，进行精密称定。

6．观察天平平衡点时，应在天平门完全关闭后读取，并连续读取2-23次。

7．天平不得超负荷使用。

8．称重时砝运到应顺序取用，最重的砝码应放在天平盘中心。

9．加砝码试重时，应由大至小依次增减砝码，轻慢地旋转升降旋钮，发现指针偏斜很快时，应立即关闭升降旋钮，再酌量加减砝码。

10．挥发性的吸湿性物质应置密闭容器内称重，酸、碱等腐蚀性物质应绝对避免附着天平盘上。

11．加热物质称重时，应放冷至室温再进行称量。

12．分析同一检品，若需数次称量，则应使用同一架天平和同一组砝码，以减少误差。

13．称量完毕立即将重量记下，应先查砝码盒内空位，记下重量，然后以先大后小次序取下砝码放入砝码盒中，并作一次核对，称完后，应将被称物立即取出。

14．称量过程中如发现称量可疑，或连续称量次数较多，应随时检查平衡点有无变动。

15．称量完毕，必须检查升降旋钮是否关闭，被称物体和砝码是否取下，自动加砝码的天平要检查刻度盘是否指在零上，然后关闭天平门，切断电源，罩好天平套。

（八）WXG自动指示旋光计的作用

1．按仪器标注的电压接通电源开关，经5-10分钟钠光灯发光稳定后开始测定。

2．将滤色镜片置于样品室左端槽里，将装有蒸馏水的测定管放入样品室，盖上箱盖。

（1）测定管中若有气泡，应先使气泡浮在凸颈处。

（2）测定管两端扩片的雾状物及水滴，应用软布擦干。

（3）测定管两端螺丝帽不宜旋得过紧，以免产生应力，影响读数。

（4）测定管安装时应注意位置和方向，以保证每次测定的一致性和准确性。

3．打开示数开关，调节零位手轮，使旋光示值为零。

4．关闭示数开关，取出测定管，弃蒸馏水，用待测溶液荡洗3次，将待测溶液装入测定管中，按相同的位置和方法放入样品室内，盖好箱盖。

5．打开示数开关，示数盘即能自动给出该样品的旋光度。示数盘上红色示值为左旋，用（-）表示；黑色示值为右旋，用（+）表示。目前较先进型号的旋光度由电子管或液晶显示，或打印记录但操作方法基本一致。

6．逐渐按下复测旋钮，重复3次读数，取平均值为测定值。

7．使用完毕后，关闭电钮，断绝电源，并将测定管立即用水洗净，晾干。

（九）雷磁25型酸度计的使用

1．装置电极 仪器配用221型玻璃电极和22型甘汞电极，玻璃电极的塑料帽夹在小夹子上，玻璃电极导线的插头全部手插在插孔内，甘示电极的金属帽夹在电极夹大夹子上，电极的高度可以利用电极夹上的支头螺丝任意调节。

（1）置pH-MV于“pH”位置。

（2）将适量缓冲溶液注入试杯，将电极放入溶液中，使玻璃电极之玻璃球及参比电极之毛细管全部浸入溶液，轻轻摇动试杯，使之均匀。

（3）将浓度补偿器尖头旋钮指于溶液相同之温度。

（4）根据缓冲溶液的pH值，置量程选择开关于pH范围“0-7”或“7-14”。

（5）调节零点调节器使指针指于pH7。

（6）按下读数开关，使电极接入仪器，如要揿住读数开关，按下后向右旋动少许即可，然后调节定位调节器，使指针指示标准溶液的pH值。

（7）放开读数开关，指针应在pH7外，如有变动，应调节零点调节器，并重复6、7之操作。

（8）校正至此结束，以蒸馏水冲洗电极与试杯，校正后勿再旋动“定位调节器”，否则必须重新校正。

（1）用滤纸轻轻地将附在电极上的剩余溶液嘛干，或用被测溶液洗涤电极，然后将电极浸入被测溶液中轻轻摇动杯使溶液均匀。

（2）被测溶液之温度需与标准缓冲液相同，否则需调节“温度补偿器”至被测液之温度。

（3）指针在放开揿开关后必须指于“pH7”处，否则应调节零点调节器至“pH7”处。

（4）按下读数开关，指针所指之值即为该溶液的pH值。

（5）若指针读数超出刻度范围“0-7”标度尺之左端，可将量程选择开关置于“7-14”的位置，然后重复（3）与（4）的操作。

（6）测量完毕，放开读数开关，冲洗电极。

4．电动势的测定 将pH-MV开关置于所需+MV或-MV处，温度补偿器和定位器不起作用，调零时指针应调至0MV处，其它操作同上，即可进行电位测定和电位滴定。

1．将折光计安置于充分光线的平台上（但不可受日光直射），并装上温度计，必要时可连接恒温器，以保持一定温度。

2．使棱镜透光后朝光源，将镜筒拉向观察者，使成一适当倾斜度。

3．对疹反光镜，使视野内光线最明亮。若在傍晚或光线不足室内，或测定色泽深的检品，可将棱镜上的圆窗打开，以增加光线强度。

4．将下棱镜拉开，用玻璃或吸管取检品少许（1-2滴）滴在镜面上，然后将上下两块材镜合拢、扣紧。

5．旋转刻度尺旋钮，使读数在检品折光率附近，然后放置补偿器旋钮使视野内明暗分界恰位于十字交叉点，如此反复操作三次，取三次读数的平均值。

6．打开读数筒小反光镜，适当采光，记下刻度尺的读数及温度，即为该温度时检品的折光率，左则系含蔗糖百分率读数，右则为折光率读数。

7．测定完毕，如检品为水溶液，应随即用脱脂棉吸去检液滴蒸馏水干标棱镜上，再用脱脂棉吸干，反复洗涤3次，最扣用拭镜纸或脱脂棉轻轻揩拭干净。如检品为油类物质，应随即用蘸有二甲苯或乙醚的脱脂棉将棱镜按上法揩拭干净。

（十一）72型光电分光光度计的使用

1．检查供电电源与仪器所标注的电压的否符合，插上电源。

2．把单位光器的光路闸门板到黑点位置，将微电计电源开关旋到“开”处，此时指方向调节光点即出现在标尺上。用零点调节器将指示光点调于透光率标尺“0”位上。

3．启开稳压器的电源开关和单色光器的光源开关，把光路闸门扳到经点，再按顺时针方向调节光量调节器至光门适当开启，使微电计的指示光点达到标尺的上限附近，隔10分钟，待硒光电池趋向后，再开始使用仪器。

4．将单色光器上的光路闸门重新扳到“黑”点处，再一次校正微电计指示光点于“0”位，开启光路闸门。

5．打开吸收池暗箱盖，取出吸收池架，将一只吸收池内装入空白溶液或蒸馏水，其余3只装入待测溶液。把已放有吸收池的吸收池架重新置于暗箱内定位装置上，盖好暗箱盖。装空白溶液的吸收池应放在吸收池架的第一个格。以便操作。

6．用波长调节器把所需的波长调节至对准红线（此时盛空白液的吸收池正在光路上），按顺时针方向轻轻旋动光量调节器，把指示光点调于透光率100的读数上。

7．将吸收池定位背装置拉杆拉出第一格，使第一个未知浓度的溶液进入光路，此时微电计标尺上所指的读数即为该溶液的吸收度及透光率。再依次将第二及第三个未知浓度的溶液推入光路内。读取其吸收率和透光率。

8．在未各有浓度溶液测定前，应先配一系列浓度的标准溶液，测其吸收度，坐标纸上以浓度作横坐标，吸收度作纵坐标，绘出溶液的标准曲线。

9．使待测定溶液处在光路中，来回转动波长调节器，与透光率最低值相对应的波长（即吸收度最大的波长），即为所选择的波长。

（十二）751型分光光度计的使用

1．按仪器标注的电压接通电源，将放大器开关及钨灯（或氢弧灯）开关拨至“开”处，预热20分钟，将暗电流闸门拨至“关”的位置，选择开关扳至“校正”，波长刻度旋钮至所需要的波长上。

2．选择适当波长的光电管，手柄拉杆推入为蓝敏江电管（200-625nm），拉出即为红敏光电管（625-1000nm）。按相应的波长选择光源灯（钨灯适用于波长在320-1000nm范围内，氢弧灯适用于320dnm以下），将主机后面的反射镜手柄转向所用光源灯。根据需要还可在光路中插入一滤光片，以减少杂散光（一般情况不必要）。

3．选择适当的呼吸池，350nm以上波长可用玻璃吸收池，350nm以下的波长一定要选用石英吸收池。将待测溶液与空白溶液分别注入适当的吸收池中，放入吸收池托架内，盖好板盖。

5．向右放置灵敏度旋钮，在正常情况下，从左边停止的位置向右转3-5圈。

6．移动样品槽手柄，使标准液移至光路中，应注意使滑动板处于定位槽中。

7．将透光率旋钮旋至透光率100%。

8．将选择开关扳到“X1”上。

9．拉开暗电流闸门，使单色光进入光电管。

10．调节狭缝旋钮，使电表指针大致指在零上，然后用灵敏度旋钮细微调节，使电表指针正确指在零位。

11．拉动试样槽手柄，将样品溶液置于光路中，此时电表所指偏离零位。

12．旋转透光率旋钮，使电表指针重新移至零位。

13．待平衡后，将暗电流闸门上，以保护光电管。

14．读取透光率或相应的吸收值。当选择开关放在“X10”时，透光率范围为0-100%，相应的吸收率为∞0；当透光率小于10%时，可把选择开关放在“X0.1”的位置，此时读出的透光率数值应以10除之，或将读出的吸收度值加上1。

15．用同一空白溶液测试几个样品溶液时，只需重复（11）-（14）项操作即可。

16．仪器用毕，应依次关闭放大器械、钨灯（或氢弧灯）电源，将选择开关扳至“关”处，狭缝旋钮旋至0。01,波长旋钮至625nm处，透光率旋钮至100%。暗电流旋钮及灵敏度旋钮赂左旋到底，取出盛溶液的吸收池，用水冲洗干净，晾干备用。

（十三）红外分光光度计的使用

固体样品采用压片法或糊剂法处理，液体样品直接取一小滴，夹到样品池的两窗片之间，控制一定的厚度（一般为0.01-0.1mm）即可。

1．检查供电电源与仪器标注的电压是否相符，不符应调压，仪器中的三芯电源线必须同时使用，不可将线接错。

2．打开电源开关，预热10-15分钟。

3．装上图纸和需要的记录笔，使记录笔恰落在图线的4000cm-1线上。

4．调节时间常数开关、扫描方式开关、狭缝旋钮、100%调节旋钮及增益开关到需要的位置。

5．将标准样品聚苯乙烯蒲膜（厚度为0.05mm）置于样品架上照射，将扫描结果与标准图谱核对，用2851cm-1、1601cm-1、1028cm-1、907cm-1的吸收峰对仪器的读数进行样正，在200～400cm-1区间允许相差±4cm-1，在4000～2000cm-1区间允许相差±8cm-1。上述光谱中，仪器要求在3110～2850cm-1范围内能清晰分辨出7个峰，从1583cm-1最高点至1590cm-1最低点的波谷浓度不小于12%T，从2851cm-1最高点至2870cm-1最低的波谷尝试不小于18%T。

6．把准备好的样品置于样品池中，再放于仪器的样品架上。

7．按下仪器的启动开关，仪器即自动从4000cm-1进行扫描，直到200cm-1自动停止。

8．撕下图纸，取出样品，关闭仪器电源及总电源开关。

9．取下记录笔，放于笔架上，用硬纸板将红外线入口关好。

10．用细绸布将仪器擦拭干净，放置于燥硅胶，盖好防尘罩。

（十四）荧光分光光度计的使用

对仪器进行灵敏校正、波长校正、激发光谱和荧光光谱校正后，按各药品项下规定，配制对照和供试品溶液。道德按仪器说明书要求的方式，选定激发光波长和发身光波长，并在测定前，用一定浓度的对照液校正仪器的灵敏度，然后在相同条件下，读取对照溶液及其试剂空白与被试品及其试剂空白的读数即得所测值。

（十五）PC-3B型药物溶出度仪的使用

1．水箱补水水达到水平线即可。接通电源，预置温度键，按下转轴电机开关。

2．转篮法除另有规定外，量取经脱气处理的溶剂900ml，注入每个操作容器内，加热使溶剂温度保持在37±0.5℃，调整转速使其稳定。取供试品6片（个）分别投入6个转篮内，将转篮降入容器中，立即开始记时。除另有规定外，至45分钟时，在转篮上端液面中间离烧杯壁10mm的取样点吸取溶液适量，立即经0.8μm滤膜滤过，自取样至滤过应在30秒中内完成。取滤液，照该药品项下测定，算出每片（个）试品的溶出量。

3．浆法除另有规定外，量取经脱气处理的900ml，注入每个操作器内，加温使保持在37±0.5℃，调整转速使其稳定。取供试品6片（个），分别投入6个操作容器内，立即开始计时。除另有规定外，至45分钟时，在浆液上端液面中间离杯壁10mm的取样点收取适量溶液立即经0.8μm滤膜滤过，自取样至滤过应在30秒内完成，取滤液该药品项下规定的方法测定算出每片（个）试品的溶出量。

4．结果判断转篮法和浆法结果判断原则相同。6片（个）中每片（个）的溶出量，按标本含量计算，均应不低于规定限度（Q）。1～2片（个）低于规定限度，但不低于为标示含量70%。如6片（个）中仅有1～2片（个）低于规定限度，但不低于Q～10%，且其平均溶出量不低于规定限度，仍可判断为符合规定。若6片（个）低于Q～10%，应另取6片（个）复试。初、复试的12片（个）中仅有1~2片（个）低于Q～16%，且平均溶出量不低于规定限度，亦可羊为符合规定。每个转篮中供试品的取用量如为2片（个）以上，算出每片（个）的溶出量，均不低于规定限度（Q），则不再复试。

5．累积溶出量的测定除另有规定外，量取经脱气处理的溶剂900ml，注入每个溶出杯，加温溶剂使保持在37±0.5℃，调整所需转速，使其稳定。精密称量的供试品6片立即计时，按预先设计的时间间隔准确取样，操作同转篮法。每取一次样品液后立即沿杯壁加入相同体积并经预热到37℃的溶剂。取出的样品液按法测定浓度，计算溶出量和进行数据处理。

6．其他每次测定开始，均应盖上溶出杯盖。测定结束依次关掉转轴电机、控温键、电源开关，去掉溶出杯盖，把转轴提升至最高位置，翻起机关箱。清洗溶出杯。结果较长时间不用，应将转轴取下，擦干后放务件箱内，并放掉水浴箱中的水。

（十六）TDx快速血药浓度检测仪应用

（1）开机前，打开左侧盖，接缓冲液管，同时检查缓冲液量是否充足。注意注射器内不可有气泡，用蒸馏水清洗探头后，用吸水纸轻轻将其粘干。

（2）启动开关ON（在TDx机左后位置），开机。

（3）电脑操作视屏显示DATE，按月、日、年顺序输入时间，如时间序数为个位数，则在其前面加“0”。按下“STORE”键，视屏显示“TIME”键。

（4）TDx机预热5分钟（倒数计），注意显示屏出现“REAKY”。

2．药物浓度检测操作程序

（1）样品准备：抽取病人血液1～2ml，静置使其自然沉淀，用吸管吸取50l的血清加入样品杯，注意检查血样品有无气泡。

（2）准备药盒：由冰箱（2～8℃）内取出检测的药品试剂盒（注意核对），水平轻轻来回摇动试剂盒，以避免药物沉淀致吸取药物浓度不均。打开3个瓶盖与药品一致不可乱盖，然后将试剂盒放入TDx机试剂盒槽内。

（3）准备转盘：用标有数字之样品转盘，按检测样品数由转盘1～20顺序加入等量的玻璃比色管和塑料样品杯。加样操作同样品准备。然后锁上转盘，手持转盘中央之轴顺时针方向转动，听到“咯嗒”一声，将转盘放入TDx机中。

（4）盖上机门，视屏显示“READY”后，方可进行以下操作。

（5）进行检测，按下“RUN”，之后一切由仪器自动操作。注意此期间内绝不可打开机门，不能按键。荧屏显示“DONE-REMOVERPAK”，取出试剂盒。同时伴有“…”声，即检测全部完成。打开机盖，取出试剂盒，盖好盖，位置不能弄错，然后盖上机盖，将试剂盖放入冰箱（2～8℃）保存，以备后用。

（6）分析结果，清洗探头。

（7）写出报告在操作过程中听到“…”声响时，应立即查看荧光屏上指令，及时发现问题并予处理。若无问题则是全部检测结束，应取走药盒，撕下打印报告。

（8）重读资料按“SYSTEM4.IRUN”，把结果打一遍，按“SYSTEM4.2RUN“把结果显示一遍。

（9）标准曲线、质控及光路检测、温度检测、吸量检测等均按有关程序操作。

（1）按“PRIME”键多次。

（2）将探针拉到中间位，用蒸馏水洗探针头，然后用清洁软纸吸干净。

（3）若停机数天后才启动TDx机，需要打开TDx机左侧机盖，取出连接缓冲瓶的塑料管，然后接蒸馏水瓶。再按“PRIME”多次，清洗注射器。

（4）将TDx开关按到“OFF”，开启机门，查看TDx机内有无试剂污染，若有可用清水棉球擦之。

（十七）气相色谱仪使用

1．固定相气液气谱法的固定相就是已涂渍固体液的担体。常用于血药浓度测定的固定液有SE-30、OV-1、OV-17及PEG-20M以上，适用于分离甾体、生物碱及绝大多数药物。OV-17等为中等极性物，最高使用温度为350℃，对有极性官能团的药物有较大的选择性，PEG-20M是分子量为2万的醇类固定液，极性较强，最高使用温度在250?/FONT>C以下，适于极性较小药物的分离。

用于涂渍因定液的担体是无机硅藻土类担体，有酸洗和碱洗耳恭听两种，其表面已纯化，适用于气液色谱法。

固定液的涂渍方法，以使用OV-17为例说明，称取占担体为3%的OV-17，溶于乙醚或氯仿中。将称好的担体一次加入，迅速搅匀，并不时搅拌，放于通风处，待溶剂完全挥发后放在烘箱中加热老化以物底除去残余液体及挥发性杂质，并促使固定液牢固均匀地分布在担体表面及毛细孔洞中。

层析柱在填装前，先将不锈钢用5%NaOH、水、乙醇、乙醚依次洗涤，最后用水冲洗至中性，烘干。如选用的是螺旋形柱，则用抽气法将涂好的担体装入。如先用U形柱，则边装边敲击，将装好的柱联入仪器中，用较低的载气流速，在略高于实验使用温度但低于固定液的最高使用温度条件下，处理几小时至十几小时直至基线走直为止。

2．流动相流动相（常称载气），有氮、氢、氦、氩等气体，由高压瓶供气。载气中的氧、烃类及水分等杂质必须除尽或只允许一定的限量。载气流量变化应小于1%。

3．进样与检测经过前处理的试样，取1~10μl注入仪器的进样品，速度要快，否则影响柱效；每次注样必须准确一致，保证出峰的重现性。之后，由载气将组分带到检测器。检测器能将组分的浓度或质量转变为容量测量的电信号，以峰的形式记录或显示。气相色谱法的灵敏与否，关键在于检测器。适用于血药浓度测定的检测器有以下几种：①氢火焰发离子化检测器（FID），对有机物质的检测限为50mg。②电子捕获检测器（ECD），对负电性有机物的检测限pg级。③氮检测器（N-FID），对含氮有机物的检测限为ng级。④质谱检测器（NSD）常和气相色谱仪联用。若将特征碎片重复扫描几百次，获得由强度及扫描时间组成的色谱质谱峰，检测限在ng-pg级。

（十八）高效液相色谱仪的使用

1．色谱柱它包括空柱和填料。空柱是内壁抛光的不锈钢管，内径为4～5mm，长100～250mm。按气相色谱法中洗涤空柱的方法洗净，用匀浆法填充固定相。将此柱装入仪器的管路中，用柱式机械往复泵输入新鲜脱气的流动相。等基线平直后可用苯、萘、菲的混合试液，用正己烷（含0.05%甲醇）或甲醇：水（83：17）为流动相测定柱效及分离度塔板数在2～3万/ml以上及分离度在1.5以上者，柱效好。为防止柱污染，常用1个50mm长，4~5mm内径，装有硅胶（40-50mm）或立柱相同填料的保护柱（预柱）接在主柱之前，以延长色谱柱的寿命。反相键合相柱用毕。必须用水充分流经，以洗去盐类、酸碱等杂质防止柱生锈及填料中杂质的积聚，再用甲醇流经洗涤使色谱柱获得再生。

2．流动相的洗脱方式配好经脱气的流动相放于贮液瓶中，经过有滤过头、内径2mm的聚四氟乙烯管流入高压泵进入色谱柱，最后自检测器流出或收集或作废液回收。用流动相洗脱的方式有恒溶剂脱洗法（isocratic dlution），即自洗脱开始到结束，溶剂的配比恒定。另一类为梯度洗脱法（gradicnt clution）,即使溶剂的极性强度在色谱过程中逐渐增加。须按一定程序不断改变流动相的浓度配比，从而使同一个试样中组分性质相差较小的及较大的都能在一次色谱过程中很好分离，而整个色谱过程缩短。必须注意，梯度洗脱法不能用于分子排阻色谱及用电化学检测的反相高效液相色谱法中。

3．检测器适用于血药浓度的检测器有紫外线吸收，荧光发射和电化学三种。紫外检测器应用于对紫外光有吸收的药物，大多数药物分子对紫外光有吸收，故能较普遍采用，检测限有0.1μg左右。紫外检测器有固定波长型、可变波长型及扫描器，既能使流动相停流作组分的定性定量检测，又能提高测定灵敏度，重现性较好。荧光发射检测器对能产生荧光的药物才能使用。80年代应用激光替代氙灯光源，光强度增加了3~4倍，对某些药物的检测限可达pg级。电化学检测器是由一个碳糊或破碳做成的蒲层电解池。常用于检测酚胺类及有酚类基团的各种药物和代谢物。流出组分进入2μl的薄层电解池，在一暄电压下电解产生电流，放大后检测，检测限pg级。

4．数据处理现代高效液相色谱仪带有数据处理系统，除记录谱外，还能自动记录峰的保留时间，能自动积分求算峰面积，并能按照预定的程序作有关计算，报告分析结果。

四、仪器设备的保养与维修

仪器设备在使用过程中，由于仪器本身（如寿命、易损件）或人为（如违反电压、温度、湿度）等因素，常会发生故障或损坏而被停止使用，必须及时进行维修。仪器设备在使用过程中，由于物体的运动，必然全产生技术情况的不断变化，因此要经常做好仪器设备的保养与维修，以改善其技术状况。

（一）仪器设备的保养与维修管理

1．日常保养一般实行三级保养制：

（1）日常保养（或称例行保养）由仪器保养人负责。它的内容是：表面清洁、紧固易松动的螺丝和零件，检查运转是否正常，零部件是否完整。日常保养的项目和部位较少且大多数在仪器设备的外部。

（2）一级保养：由仪器保养人按计划进行。主要是内部清洁，检查有无异常情况（如声音、湿度、批示灯等）局部检查和调整。

（3）二级保养：是一种预防性的修理，由仪器保养人会同修理人员共同进行，检查仪器设备的主要部分或主要部件，调整精度，必要时更换易损部件。

2．仪器设备检查是对仪器设备运行情况、工作精度或磨损程度进行检查校验，针对发现问题，提出改进维护措施，有目的地做好修理前的各项准备，以提高修理质量，缩短维修时间。一般与二极保养结合进行。从检验性能来区分，可有两种性质的检查：一是功能检查；二是精度检查。功能检查测定仪器设备的各项功能是否符合仪器说明书技术文件要求。精度检查指测定设备的精度，特别是计量仪器，如天平、分光光度计等，还需定时由国家计量部位来检查、鉴定。平时的定期检查还应特别强调设备的安全检查，包括仪器本身的安全性、用电安全和周围环境的安全。

3．仪器设备的修理主要由维修人员负责。修整可分为：

（1）小修理：工作量最少的局部修理。在设备所在地点更换或修复少量零件或调整设备的结构，以保证设备能使用到下一次修理。

（2）中修理：需更换与修复设备的主要零件或为数较多的其他损坏部件或校正仪器以恢复其精度，达到设备规定的技术参数。

（3）大修理：是工作量了大的一种修理，有时需将设备全部解体，更换或修复全部损坏的零件，恢复设备原有的精度、性能和效率。

4．仪器维修登记制度仪器设备在保养维护和修理后必须登记，包括：保存文字记录，记载修理日期，使用人主诉仪器故障现象，修理人所见的故障现象，故障原因，排除方法，零件或电路改变情况，修复后的检验情况（如不能修，说明原因和建议），由修理人和保养人签字，用以保存完整的设备技术档案，便于修理人员了解仪器设备的历史，也可作为对使用人、保养人和维修人的工作考核依据。

5．设备维修的主要技术指标

设备保养与维修管理的主要技术指标以设备完好率表示：即完好和基本完好设备占总设备件数的百分率。一般仪器设备技术状况分为四个等级：

（1）设备完好：性能良好，盍使用正常，零部件齐全，无明显磨损、变形和腐蚀，仪表批示系统正常。

（2）设备基本完好；主要性能保持良好、运转基本正常，不经常出现故障，主要零部件齐全，虽有一定磨损、腐蚀、但不影响使用，仪表批示系统基本正常。

（3）设备情况不良：主要性能不良，常出现故障，主要零部件受损，使用受到影响，仪表指示系统有一定程度的失调，停机修理或待修，上述情况出现其一者。

（4）报废或待废：己丧失主要性能，不能正常运转使用或受到严重影响，经常出现较大故障，主要零件不全，要有专人负责保管，务必经常保持完整清洁。

（二）常用药学设备的保养与维修

（1）天平与砝码要有专责保管，务必经常保持完整清洁。

（2）天平应放在干燥、无日光直身与不易受热、受冷的地方，室内应无有害气体或水蒸汽。天平台必须平坦、牢稳、坚固。

（3）天平内应放置干燥剂如硅胶等，并需定时更换以保证天平内空气干燥。

（4）天平在放妥后不应经常搬致力，必须搬动时，需将天平盘及横梁零件先行卸下。

（5）天平各部件要定期检查，保持清洁，各零部件若有灰尘，应用细软毛刷轻轻扫指，注意铁使螺丝转动或损害刀刃。

（6）如发现天平失灵、损坏或有可疑时，应即停止使用，不得任意拆弄零件或装配零件。

（7）凡自干燥器内取出称样，要称量前必须仔细检查空中底部是否沾有污物。如沾有，应清除后方可进行称量。

（8）天平使用期间，应按规定由国家法定计量单位定期鉴定，并持有合格证书。

（9）天平砝码应保持清洁，勿沾有棉毛纤维、灰尘及化学药品。天平光幕表面及镀铝的反光镜不准用布擦拭，以免磨损光洁度，必要时可用软毛刷轻指。

（10）使用砝码应用专用镊子夹取。

（11）砝码在使用一定时期后，要用擦镜纸轻轻揩拭，严禁任意拆卸、刮削或用去污粉擦洗。揩拭后需经校准方可再用。

2．WXG自动批示校准旋光计的保养

（1）旋光计必须放置暗室内内或专用木盒内，存放的房间必须注意防潮，防腐蚀性气体，更不可放置于高温炉旁。

（2）使用仪器时，应保持有足够的电压。仪器所标注电压一般为220V，加实测时电压不符合此标准，应通过调压变压器将电压调至220V。否则，电压低会使仪器灵敏度降低；电压高会使小数盘摆动不定。

（3）测定管、光学下班片和橡胶圈，每次洗涤后，不可置烘箱中干燥，以免变形及橡皮圈发粘。

（4）测定管盛放有机溶剂后，必须立即洗净，以免橡胶圈受损发粘。

（5）测定管两端的光学圆玻璃片，使用时需特别小心，避免磕碰，并只能用擦镜纸揩拭，以防磨损。

（6）被测样品超过测量范围时仪器可在±45°C处自动停车。此时应取出测量管，按一下样品室前右上角的按钮，仪器即可自动回零位。

（7）如旋光计上的淘汰系钠光灯，使用时间一般勿超过2小时，并不宜经常开关，开启后禁止震动。

（8）每次使用后仪器各部位均应仔细检查，保持干净，然后放置原处。

（9）本仪器久用后，其机械部分磨擦阻力增大，可打开后门板，在伞形齿轮及涡轮涡杆处加少许润滑油以减少摩擦力。

（10）如无钠光灯或滤光片，可将光线通过硫酸铜或铬酸钾的混合液（CuSO₄5HO₂8.1g和K₂Cr₂O₇9.4g溶于300ml蒸馏水中），液层厚度为3cm。

3．雷磁25型酸度计的保养与维护

（1）应置于平稳的台上，室内应干燥，避免震动，并防止灰尘与腐蚀气体侵入。

（2）玻璃电极球部系用极薄的特种玻璃制成，极易碰破，使用时需特别小心，安装电极时，应使甘汞电极下端较玻璃电极球部稍低约2mm，以免试杯底碰破其球部。

（3）玻璃电极初次使用，应将电极球部先在蒸馏水内浸泡数小时，最好浸泡一昼夜。用后也应把球部浸泡在蒸馏水中，电极插头上的有机玻璃管有优良的绝缘性能，切忌与化学药品或油污接触。

（4）下班电极如沾附污秽不易洗去可先后用乙醇、乙醚、蒸馏水等浸泡洗涤。

（5）221型玻璃电极的线性范围为0~9.5，测定pH9.6以上溶液时应校正钠离效益引起的误差。一般不应测强碱性溶液（pH11以上）。如必须测定应尽量快速测，使用后，球部应以1mol/L盐酸液浸泡片刻，再用蒸馏水洗净。

（6）甘汞电极在使用时应注意氯化钾是否充足，必须能够浸没内部的小玻璃管下口，且在弯管内不准有气泡将溶液隔断。溶液不足时应加入纯饱和氯化钾溶液。

（7）甘汞电极的下端为一塞有石棉丝的毛细孔，在测量时允许有少量氯化钾溶液流出，但决不允许有被测溶液流入。如有其他溶液流入甘汞电极内，将导致测量结果不准确，故在使用时最好把甘汞电极侧面的小橡皮塞拔去以保证有足够的液位差，断绝被测溶液流入的可能性。

（8）甘汞电极不用昌，可用橡皮套将下端毛细也套住切勿与玻璃电极一起浸泡于蒸馏水中。

（9）每次测定前，电极及试杯均应充分洗净（最好用被测溶液冲洗耳恭听一次）。如测定弱缓冲作用的溶液，应注意玻璃电极表面不易平衡，电极在测定前虽经充分冲洗，但仍有读数不胜数逐渐改变的现象，此时宜重换一份被测液再测，直到读数在一分钟内改变不超±0.05(pH)为止，取最后一份读数为溶液的pH值，有时需换测三至五份。在测定极稀溶液或蒸馏水时，其读数会随校正仪器所用缓冲液的pH值而异用酸性缓冲液校正后测定值偏酸，而用碱性缓冲液校正后测定值偏碱，因此在测定极稀溶液或蒸馏水时，应用邻苯二钾酸氢钾标准缓冲液（在25°C时pH=4）校正仪器，按上述法测被测液，再用硼砂标准缓冲液（在25°C时pH=9.18）校正仪器测定疲测液，有时被测液需换五至六份，两次校正的最后两份的pH值差应不大于0.1，取其平均值为溶液的pH值。

（10）校正仪器用的标准缓冲液，应选择与被测溶液相接近者，以减小误差。

（11）校正仪器用的标准缓冲液与测定的准确度有直接关系，最好用单一种酸性或碱性盐来配制，如用两种盐类混合配制则误差较大。使用的试剂要在2级以上。硼砂易风化吸收二氧化而，遇此情况应重结晶后方可使用。配制溶液应用新煮沸放冷的蒸馏水，缓冲液在使用过程中应尽量避免接触空气，以免吸收二氧化碳使其pH值改变。一般使用期限勿过长，如发现霉菌，则应弃去重新配制。

（12）搬动仪器应将量程选择开关置于“0位”，此时已将电表断路，以保证移动时电表的安全。

（13）酸度计及所附电极组应每年检验一次，以保证准确无误。

4．折光计的维护和保养

（1）每次使用完均需整洁一次，然后装入专用的木盒中，盒中放置硅胶干燥剂，以免受潮。

（2）滴加样品所用玻棒吸管，在滴加栓品时不可碰击棱镜面需用擦镜纸或脱脂棉轻轻揩拭。

（3）测定完毕，棱镜面应按使用方法（7）进行清洗，使用恒温器，必须倒尽金属器内的积水。

（4）测定油脂类栓品后，必须用丙酮或乙醚拭净沾有检品的一切零件。

（5）折光计不可用来测定强酸、碱或有腐蚀性的物质。

（6）校正用玻块，应保持完整，绝不可碰遗失以免损伤。

（7）折光计需用放置于干燥无尘室内，不可在有酸碱性气体或潮湿的试验室中使用，更不可放于高温炉或水槽旁。

5．72型光电分光光度计的维护保养

（1）供给仪器的电源电压变化范围不应超过190~230V。供电电源插座上须装有地线。

（2）仪器应安装在不易振动的台上，以免影响微电计指示光点的稳定。应保持周围环境清洁、干燥、无腐蚀性气体存在，并避免阳光直射。

（3）使用时，应经常开闭光路闸门，以核对微电计的“0”点位置是否有改变。

（4）应注意吸收池在其架内的位置，应尽量使其保持前后一致，否则易造成分析误差的准确度。

（5）测定尽量在吸收度值为0.3~0.7的范围内进行，这样可得到较高的准确度。

（6）单色光器电源电压，在被测液色度不太强的情况下，应采用较低电压的电源（5.5V）。这样不但可以降低单色光器部分的温度，且可以延长光源灯泡的寿命。

（7）仪器的连续使用时间不应超过2小时，可间歇30分钟后再继续使用。

（8）吸收池每次使用完，均应用蒸馏水洗净揩开，放在吸收池盒内。

（9）搬动时须小心轻放。

6．751型分光光度计的保养与维修

（1）为确保仪器工作稳定，在电源电压波动较大的地方，应采用稳压措施，最好另务一台稳压器。

（2）仪器接地要好，一切裸露零件的对地电位不得超过24V。当仪器工作不正常，哪无输出、批示灯不亮或电表指针不动时，要先检查保险是否融断，后检查线路。

（3）新仪器使用前及修理后再使用，均应对仪器性能进行综合检定。波长精度还应定期校正。对在紫外区波长精度要求高的分析，应于每次分析前进行波长检查（一般可用氢灯的486.1nm和655.3nm两条谱线进行核对，可不必全面进行校正。）

（4）要经常更换仪器中装的干燥剂，如发现变色即应取出烘干再用。要严防潮气侵入。光学部分受潮后则会发生浑光甚至发霉，从而影响单色光的纯度；若放大部分受潮，则使仪器不稳定。

（5）测定前，先将仪器各暴露部分如灯室反射击镜等上的灰尘用干燥空气吹除，切勿擦拭。如有油污或灰尘太多吹除不尽，则可拆卸后然后再用清洁蒸馏水冲冼，干燥后装还原位。

（6）光源如氢灯或钨灯泡可用乙醇擦拭干净后使用。换灯光或调节灯位置时，不可直接去拿灯泡因手汗中含有氨基酸或其他污物，灯泡通电受热后可留下指纹或其它污迹而影响光的强度。

（7）注意保护吸收池的光学表面，不可用手擦拭或抚摸，避免手汗或污物的污染。测定手应立即倒出被测溶液并及时清洗干净（一般用配制溶液的溶剂洗涤数次后再用蒸馏水洗净。若太脏，可用新配制的铬溶液短时浸泡洗涤，并以蒸馏水反复冲洗干净）。

（8）仪器停止工作时，必须切断电源。将选择开关置于“关”，狭缝旋转到0.01刻度，波长旋至625nm，透光率旋钮至100%上。为了避免仪器积灰和被污染，仪器不用时要用罩子将整台仪器罩住，并在罩内放数包硅胶防潮。

（9）751型紫外光光度计常见故障、可能原因、检查方法及维修处理见表10-1。

表10-1 国产751型分光光度计常见故障及其维修处理